Departemen Teknologi Industri Pertanian FATETA - IPB 2012 m.K DASAR REKAYASA BIOPROSES (TIN 221 /2(2-0) IMOBILISASI ENZIM Departemen Teknologi Industri Pertanian FATETA - IPB 2012

(membuat konformasi aktif enzim tahan terhadap lingkungan) Larut dan tidak stabil Hanya dapat digunakan satu kali dalam larutan bebas Enzim sangat mahal dan merupakan bahan yang sulit diperoleh dalam jumlah memadai (isolasi & purifikasi)  Harus digunakan cara yang ekonomis dan dapat memperpanjang aktivitas biologisnya Imobilisasi (membuat konformasi aktif enzim tahan terhadap lingkungan) Terbentuk struktur granula enzim padat yang stabil dan tidak larut air.

TEKNIK IMOBILISASI ENZIM DEFINISI (Chibata, 1978) Enzim yang secara fisik ditempatkan di dalam suatu daerah/ruang tertentu, sehingga kestabilannya meningkat dan dapat mempertahankan aktivitas katalitiknya serta dapat digunakan secara berulang-ulang dan kontinyu. “Imobilisasi = biokatalis terbatas pergerakannya diakibatkan oleh perlakuan fisik atau kimia, sehingga konformasi enzim tahan thd lingkungan Enzim menjadi bersifat tak larut (Insoluble enzyme) – mempunyai keuntungan seperti katalis heterogen klasik (yang biasa digunakan)

Keuntungan Imobilisasi : Dapat digunakan berulang  biaya << Pemisahan produk lebih mudah Penghentian proses cepat (diambil dengan filtrasi; laju alir <<) Kestabilan lebih baik dengan adanya proses imobilisasi. Produkl tidak terkontaminasi enzim cocok untuk pangan dan farmasi Dapat digunakan untuk proses sinambung ”low residence time” (high volumetric activity) & Pengontrolan lebih baik Kelemahan Imobilisasi : 1. Biaya carrier/penyangga dan proses imobilisasi cukup besar 2.Terjadi perubahan karakteristik enzim 3. Pembatasan transfer massa - problem dengan kofaktor & regenerasi - problem dengan sistem multienzim 4. Aktivitas enzim hilang selama imobilisasi

ENZYME IMMOBILIZATION METHOD “Carrier –binding” “Cross-linking” “Entrapment” Adsorpsi Fisik Ikatan Ionik Ikatan Kovalen Jenis Kisi Jenis Mikrokapsul

“Carrier Binding” (Pengikatan/Pelekatan pada Carrier) Metode Imobilisasi : “Carrier Binding” (Pengikatan/Pelekatan pada Carrier) Enzim diikat pada “carrier” (matriks) yang tidak larut air  luas permukaan & diameter pori→ muatan enzim Jenis : Adsorbsi fisik - Mudah dilakukan dan ekonomis - Enzim diadsorbsi pada permukaan “carrier” Kelebihan : - Kondisi lunak → aktivitas enzim tetap tinggi - Dapat diregenerasi Kelemahan : - Kekuatan ikatan lemah  pH atau kekuatan ion berubah → bocor! - Enzim dirusak oleh mikroba/enzim proteolitik E

Contoh “Carrier” untuk adsorbsi fisik : Karbon aktif • hidroksil apatit Gelas porous • gel Ca-fosfat Tanah liat • pati Kaolin • gluten Alumina • butil sefarosa Silika gel • concana valin A Bentonit Lar. Pati Karbon aktif Enzim Imobil Aduk 10 0C, 1 jam Amilase imobil Saring -amilase Gula

Aminoasilase + buffer fosfat (pH 7) Ikatan Ionik Terjadi ikatan ionik antara enzim dengan “carrier” yang tidak larut air dan mengandung residu penukar ion (R) Selulosa, DEAE-sefadex, “glass-fibre paper”, polistiren sulfonat Kelebihan dan kekurangan sama dengan cara adsorbsi Cara imobilisasi : E + + + + R R R R Aminoasilase + buffer fosfat (pH 7) + Substrat (camp. D/L asam amino.) Jaket air DEAE-sefadex + air L-aa Terjadi interaksi antara gugus amin (carrier) yang bermuatan positif dengan gugus karboksil (enzim) yang bermuatan negatif. Setelah 32 hari  keaktifan masih 60 %

Ikatan Kovalen Terbentuk ikatan kovalen antara enzim dengan “carrier” tidak larut dalam air  ikatan kuat & tidak bocor Gugus fungsional enzim yang berperan : .  atau -amino . , , atau -karboksil . Sulfuhidril . Hidroksil . Imidazol . Fenolik “Carrier” mengandung gugus reaktif : Diazonium Asam azida Isosianat Cyanogen bromide dll Kelemahan : konformasi enzim berubah  aktivitas hilang E “carrier”

Imobilisasi dgn Ikatan Kovalen Carrier yg memiliki gugus hidroksil (polisakarida, manik gelass) diaktivasi dgn cyanogen bromide  menghasilkan turunan imidokarbonat yang reaktif lalu berikatan dengan ggs amino enzim : support Carrier turunan diazonium yang memiliki gugus amino diaktivasi untuk imobilisasi enzim :

Cross Linking (Ikatan Silang) Terjadi ikatan kimia, tetapi tidak digunakan carrier tidak larut air Pembentukan ikatan melintang inter molekuler antara moleklul enzim dengan pereaksi bifungsional atau multifungsional. Pereaksi : glutaraldehid paling banyak digunakan diazobenzidine (atau turunannya) Etil khloroformat N-N-hexamethilene bisiodoasetat dll Untuk meningkatkan stabilitas  cross linking + adsorbsi Kopolimerisasi E polimer

Imobilisasi dg Ikatan Silang (Crosslinking) Cross Linking (Ikatan Silang) Pereaksi umumnya mempunyai 2 gugus fungsional identik yang bereaksi dengan residu asam amino Contoh pereaksi : glutaraldehida diisocyanate

Entrapment (penjeraban) Lokalisasi enzim dalam kisi matriks atau mikrokapsul (membran semipermeabel) Enzim tidak terikat pada matriks gel atau membran  tipe kisi (alginat, k-karagenan, Poliakrilamida )  tipe mikrokapsul 1 – 300 m Bahan : Nilon, poliurea, etil selulosa, polistiren, Kolodion, nitroselulosa, butil asetat selulosa dll Membran polimer permanen Mikrokapsul tidak permanen

Immobilization by Entrapment Gel Poliakrilamida

Gel kalsium alginat yang berisi enzim Cara Penjeraban Tipe Kisi enzim Makropipet 2 mL Lar. Na-alginat  2 % CaCl2 0.1 M Skala 4.5 Gel kalsium alginat yang berisi enzim

Perubahan Sifat Enzim Terimobilisasi Aktivitas V1  tidak deaktivasi enzim akibat prosesimobilisasi V2  kemungkinan untuk mengimobilisasi enzim lebih banyak/sedikit per unit berat/volume katalis Penyebab penurunan aktivitas : Konfigurasi  menghalangi substrat Gugus reaktif pada sisi aktif ikut terikat pada matriks Terbentuk konfigurasi tidak aktif Kondisi reaksi ekstrim  denaturasi V1(aktivitas relatif)  Perbandingan aktivitas enzim imobil vs enzim larut dalam jumlah sama V2 (aktivitas spesifik absolut)  Kecepatan reaksi per unit berat atau unit volume seluruh katalis

pH optimum enzim imobil Penyebab perubahan pH :  distribusi yang tidak seragam ion H+, ion OH- dan substrat bermuatan Carrier bermuatan negatif  pH optimum bersifat basa CMC, Asam galakturonat, Asam poliaspartat, anhidrida etilen Carrier bermuatan positif  pH lebih asam DEAE-selulosa, Polimer poliornithil a : enzim chymotripsin larut b :kopolimer chym – anhidrida etilen (-) c :chym – poliornithil (+) Aktivitas Relatif (%) c a b 4 7 → pH

Stabilitas Stabilitas operasi = t1/2 (half-life) = waktu dimana terjadi kehilangan 50 % dari aktivitas enzim semula k = konstanta kerusakan enzim t = waktu operasi E0 = aktivitas enzim mula-mula E = aktivitas enzim pada wktu t Stabilitas operasi ditentukan oleh : Jenis enzim Cara imobilisasi Jenis bioreaktor

Bioreaktor Enzim Imobil CSTR : Pengontrolan lbh mudah Cocok untuk kasus inhibisi (penghambatan) substrat Menghindari kontak enzim oleh substrat dan produk yang terlalu lama Reaktor Curah (Batch) : Sederhana Viskositas tinggi & aktivitas enzim rendah

Fixed-bed PFR (Unggun Diam/Terkemas) : Sinambung  paling sering digunakan Aliran substrat dpt dari atas, bawah atau daur-ulang Fluidized-bed (Unggun Terfluidisasi) : Untuk viskositas tinggi & terbentuk gas Laju fluidisasi perlu diatur agar enzim imobil tak rusak

Recycle Packed Column Reactor : - Bioreaktor dpt diopersikan dgn laju alir tinggi - Digunakan untuk substrat yang tdk dpt dg sekali proses

Pengukuran Efisiensi Imobilisasi (Aktifitas enzim yang teradsorbsi pada penyangga) Larutan enzim : - aktifitas : 591 U/mL - volume larutan : 40 mL  Total aktifitas : 40 x 591 = 23600 U Bobot Penyangga (carrier) : 11 gram  Setelah mobilisasi  Aktifitas enzim terimobilisasi : 381 U/g penyangga  Total aktifitas enzim yang teradsorbsi pada penyangga = 11 x 381 U = 4191 U Persentase aktifitas enzim teradsorbsi = 4191/23600 x 100% = 17,8 %

Imobilisasi Sel : Meningkatkan konsentrasi biomassa  produktivitas > Konsentrasi sel menentukan waktu tinggal dlm bioreaktor Operasi sinambung dg laju alir > (waktu tinggal pendek), tidak terjadi wash out Biomassa dapat digunakan kembali Pemisahan biomassa lebih mudah Metode : Carrier biding : E. coli A. oryzae, dll Entraping  paling banyak diteliti Matriks yang digunakan : Kolagen, Selulosa triasetat  tipe membran Alginat, Agar, Karagenan, Poliakrilamida  tipe kisi 3. Cross linking : E. coli

Contoh : Aplikasi sel imobil di industri

Aplikasi Enzim Imobil di Industri 1. Produksi Fruktosa dari Glukosa (HFS) Glukosa Fruktosa Glukoisomerase : Intraseluler & Mahal (diimobilisasi dg ikatan ionik - DEAE-Selulosa) 2. Produksi L-asam amino (e.g L-Metionin)  bentuk yg dapat diserap tubuh Hasil reaksi kimia  campuran asam amino : asetil D&L asam amino (rasemat) + aminoasilase imobil (DEAE-Sephadex)  terjadi deasilasi hanya pada asam amino yg bentuk L 3. Produksi Antibiotika APA (6-amino penicillanic acid) - Benzil Penisilin (hasil fermentasi) + penisilin amidase(diimobilisasi ikatan ionik dg selulosa asetat)  APA - APA + gugus metil  α-metil benzil penisilin (=Ampisilin, antibiotika spektrum luas)

Sistem Monitoring Glukosa Kolom kapiler O2 Glukosa BIOSENSOR Prinsip pengukuran : perubahan oksigen, kofaktor NADH (menyerap cahaya pd λ 340 nm) atau senyawa lain (amonia dll) Contoh (lar glukosa) Sistem Monitoring Glukosa Kolom kapiler O2 Glukosa Elektroda O2 Glukonolakton + H2O2 Glukosidase Glu.oks imobil O2  diukur dengan elektroda Recording electrometer Penentuan Asam Askorbat Asam L-Askorbat + ½ O2  asam dehidroaskorbat + H2O Askorbat oksidase O2  diukur dengan elektroda

Senyawa Kimia Enzim Perangkat Elektroda Glukosa Glukosa oksidase Elektroda oksigen Etanol Alkohol oksidase Nitrit Nitrit reduktase Elektrode gas amonia L-Tirosin L-tirosin dekarboksilase Urea Urease Elektroda gas amonia Sulfit Sulfit oksidase Asam L-askorbat Askorbat dehidrogenase Kreatin Kreatinase H2O2 Katalase

Contoh Aplikasi Produksi sirup Fruktosa dari Inulin Umbi Dahlia Dalam Reaktor Sinambung Unggun Terkemas (Fixed-bed) Menggunakan Enzim Inulinase Imobil ( Skripsi Sujatmono , T.S, 1992)

Pembuatan Substrat Inulin Ampas Umbi Dahlia Penyaringan Pencucian dan Pengupasan Pelarutan Dengan Air Substrat Inulin Siap pakai Perajangan Tepung Umbi Dahlia Pengeringan dengan sinar matahari 3- 4 jam Penggilingan, 40 mesh Pengeringan dengan oven suhu 50 – 60 0 C Irisan Umbi Kering

Pembuatan Enzim Inulinase Imobil (Novozym 230 ) Na-Alginat 1 % Pencampuran Pengaliran lewat Pompa Peristaltik Imobilisasi dalam CaCl2 0.05 M Perendaman dalam CaCl2 1-2 jam Inulin Imobil Siap Pakai 2.3 mm Pencucian manik-manik dalam Buffer Asetat Penyaringan

Bioreaktor yang digunakan

Fermentasi Etanol Sinambung menggunakan Sel Khamir Imobil 5