BIDANG KEGIATAN : PKM PENELITIAN ISOLASI DAN IDENTIFIKASI OLIGOSAKARIDA MADU LOKAL SERTA ANALISIS AKTIVITAS PREBIOTIKNYA  

Latar Belakang Madu terbukti memiliki beragam khasiat yang telah dimanfaatkan selama ribuan tahun Oligosakarida: kandungan alami madu, berpotensi menjadi prebiotik Prebiotik: komponen pangan yang tidak tercerna dan mampu memberikan keuntungan bagi kesehatan melalui stimulasi pertumbuhan bakteri menguntungkan Produksi madu hutan Indonesia mencapai 115 juta ton per tahun Kandungan dan potensi madu dari lebah hutan lokal Apis dorsata belum diketahui

Perumusan Masalah Tujuan Kandungan oligosakarida madu lokal dan potensinya sebagai prebiotik belum diteliti sehingga perlu dilakukan isolasi dan identifikasi oligosakarida madu serta pengujian aktivitas prebiotiknya Tujuan PKMP ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi oligosakarida yang terkandung dalam madu lokal serta menganalisis aktivitas prebiotiknya

Luaran Yang Diharapkan Penyusunan artikel yang secara komperhensif menyajikan metode isolasi dan identifikasi oligosakarida madu lokal dan pengaruhnya terhadap aktivitas prebiotik. Artikel ini akan diajukan ke jurnal Hayati.

BAHAN & ALAT Bahan Sampel madu dari Pulau Kalimantan Timur dan Pulau Sumbawa. arang aktif 100 mesh etanol 10% kertas saring Whatman No.1 lempeng KLT Whatman K6F asetonitril etil asetat 1-propanol metanol N*(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida standar karbohidrat reagen DNS reagen fenol sulfat getah pencernaan buatan kultur L. acidophilus kultur E. coli MRSB, MRSA TSA, TSB M9 Minimal Medium inulin komersil filter 0.45 mikron

BAHAN & ALAT (lanjutan) Peralatan gelas, oven, neraca analitik, vakum, hair dryer, chamber KLT, botol semprot, magnetic stirrer, inkubator, sentrifugasi, inkubator, penangas, spektrofotometer, KCKT dengan kolom yang digunakan adalah Aminex HPX-87H (300mmx7.8mm) dengan guard column yang mengandung cartridge H+ dan disimpan pada suhu 65oC.

Isolasi Oligosakarida (Hernandez et al. 2009) 0.5 g madu+3 g arang aktif+etanol 10% Diaduk 30’ Disaring dengan kertas saring Whatman No. 1 pada keadaan vakum Arang aktif dibilas dengan 25 mL et-OH 10% Ekstraksi monosakarida + et-OH 50% Aduk 30’ Saring pada kondisi vakum Desorpsi oligosakarida dari arang aktif Rotarievaporator vakum 40oC Simpan pada kondisi kering Pengeringan

Deteksi Oligosakarida (Vergara et al. 2010, Ato et al. 1960) Spot pada KLT dan elusi dengan piridin:buatnol:air (4:6:3) Semprot hingga jenuh dengan N*(1-naftil) etilendiamina dihidroklorida dalam metanol: as. Sulfat (97:3) Panaskan 120oC selama 8-10’

Pengujian Aktivitas Oligosakarida Resistensi terhadap enzim pencernaan Asam lambung Enzim amilase Aktivitas fermentasi Produksi asam lemak rantai pendek Stimulasi pertumbuhan bakteri Perbandingan antara pertumbuhan bakteri probiotik L.acidophilus dan bakteri enterik E.coli

IDENTIFIKASI OLIGOSAKARIDA Hasil KLT dilarutkan dalam air nanofiltrasi dan disaring dengan filter 0.22 mikron KCKT Dionex DX-300, kolom Carbo-PAC PA 100 dan CarboPAC PA 100 penukar ion, 20uL per injeksi Maltoriosa dan maltotetraosa sbg standar karbohidrat, eluen: Na-asetat, air, NaOH

Resistensi terhadap getah pencernaan Inkubasi sampel dengan asam lambung buatan Inkubasi sampel dengan enzim amilase air liur Pengukuran total karbohidrat awal (0 jam) dengan metode fenol-sulfat Pengukuran gula pereduksi metode DNS pada jam ke-0, 0.5, 1, 2, 4, dan jam

Stimulasi pertumbuhan bakteri Inokulasi masing-masing L.acidophilus dan E.coli pada media yang ditambah prebiotik Media dengan glukosa sebagai kontrol U kur OD jam ke-0 dan ke-24 pada 600 nm P rebiotic activ ity score =

Produksi SCFAs Kultur probiotik usia 24 jam + asam nitrat dan asam sulfat lalu disaring dengan filter 0.45 mikron dan disentrifugasi pada 5000g 10’ Kandungan SCFAs diukur dengan KCKT kolom aminex HPX-87H

Sampel madu lokal berasal dari Hutan Kampung Bluan Kec Sampel madu lokal berasal dari Hutan Kampung Bluan Kec. Muara Pahu, Provinsi Kalimantan Timur dan Bukit Gunung Tambora, Bima, Pulau Sumbawa. Sampel madu diambil pada bulan Februari 2010 dengan bantuan penduduk setempat. Madu lokal dihasilkan dari lebah hutan A pis dorsata. Sumber nektar untuk madu hutan asal Kalimantan Timur antara lain bunga pohon rengas, bengkirai, dan kemiri. Sumber nektar untuk madu asal Pulau Sumbawa adalah bunga akasia, samu, loa, luhu, duwet, mangga, jambu, kemiri, dan pala. Madu lokal Kalimantan berwarna jingga cerah, sementara itu madu lokal Pulau Sumbawa memiliki warna yang lebih gelap. Madu lokal

E kstraksi oligosakarida Terhitung Senin, 19 April 2010 telah dilakukan ekstraksi oligosakarida dari sampel sebanyak 25 gram untuk masing-masing madu lokal. Rendemen ekstrak yang diperoleh dari proses rotavapor vakum untuk madu lokal Kalimantan sebanyak 0.5148 gram, sementara untuk madu lokal Sumbawa menghasilkan rendemen dengan bobot 0.4488 gram. Rendemen madu lokal Kalimantan berwarna cokelat mengilap dengan tekstur seperti permen, sementara rendemen madu Sumbawa berwarna hitam dan mengilap.

Deteksi oligosakarida Rendemen dilarutkan dengan konsentrasi 4% dan volume akhir 0.5 mL lalu di spot pada plat KLT silika. Standar yang digunakan adalah glukosa dan fruktosa konsentrasi 1%. Hasil KLT madu Kalimantan menunjukkan adanya 2 buah spot dengan Retention factor (RF) masing-masing 0.641 dan 0.385. Spot dengan RF 0.641 Diidentifikasi sebagai fruktosa sesuai dengan RF dari fruktosa yakni 0.692. Madu Sumbawa menghasilkan 2 spot masing-masing dengan Rf 0.666 dan 0.410. Spot pertama diidentifikasi sebagai fruktosa. Sementara itu standar glukosa memiliki RF 0.769. Metode ekstraksi oligosakarida dengan arang aktif dan etanol belum optimum. Hal ini dikarenakan jumlah monosakarida saat KLT masih signifikan dan jauh lebih besar dibandingkan spot kedua, masing-masing dengan Rf 0.410 untuk Sumbawa dan 0.385 untuk Kalimantan, yang diduga merupakan oligosakarida. Selain itu terdapat ekor di antara spot yang diduga merupakan disakarida dan oligosakarida dalam jumlah yang sangat kecil.

Penggantian E luen (Piridin:butanol:air, 4:6:3) 0.659 0.568 0.5 0.375 0.295 0.18 0.11 0.659 0.568 0.5 0.306 0.18 0.11 Monosakarida Di- atau trisakarida Oligosakarida dengan DP lebih tinggi Resolusi cukup baik, hasil identifikasi akan dipertajam dengan analisis KCKT

Permasalahan dan penyelesaian Teknis Penyediaan senyawa standar oligosakarida madu yang diperlukan cukup memakan waktu (+ 1.5 bulan) dan harganya mahal yaitu sekitar Rp 500000-3000000 Tahap identifikasi oligosakarida dilakukan di akhir Standar alternatif yaitu maltotriosa (DP 3) dan maltotetraosa (DP 4)

Keuangan Saldo dana sebesar Rp 1711500 Kultur L actobacillus acidophilus Rp 350000 Kultur E scherichia coli Rp 350000 Pengukuran asam organik dengan KCKT Rp1400000 Identifikasi oligosakarida dengan KCKT Rp1750000 TOTAL Rp3850000

PENGGUNAAN BIAYA Tanggal Pemasukan Rp Pengeluaran Dana DIKTI 6500000 Mar 2010 Sewa laboratorium 150000 17 Mar 2010 Reagen (Pak Arya) 1225000 19 Mar2010 Bahan kimia & alat 48000 22 Mar2010 Bahan kimia 87500 26 Mar 2010 Rotarievaporator 100000 27 Mar2010 Bayar lembur 7500 01 Apr2010 107500 06 Apr 2010 85000 13Apr2010 Etanol 60000 Akuades 35000 15 Apr 2010 16 Apr 2010 20 Apr 2010 Pipet 10000 23 Apr 2010 Lempeng KLT 400000 Standar oligosakarida 2250000 TOTAL 4788500 SALDO 1711500

Terimakasih….