KAJIAN SIFAT BIOEKOLOGI DAN BIOMOLEKULER VIRUS MOSAIK BERGARIS PADA TEBU DI INDONESIA Kode : IIF/13 (Lanjutan) Dr. Tri Asmira Damayanti (Institut Pertanian Bogor ) Lilik Koesmihartono Putra, M.AgSt (Pusat Penelitian dan Pengembangan Gula Indonesia)

Gula, komoditas penting di dunia Tebu Gula, komoditas penting di dunia Kebutuhan gula nasional tahun 2005 : 3.3 jt ton, Prod.gula Nasional tahun 2005 : 2.2 jt ton, sisanya IMPOR. PENYAKIT MOSAIK BERGARIS TEBU DAPAT MENJADI PEMBATAS PRODUKSI GULA SWASEMBADA GULA PADA TAHUN 2009

TEMUAN & PERUMUSAN MASALAH Penyakit baru di Indonesia Ditemukan di 59 pertanaman tebu di Jateng dan Jatim; KP 1-62% Dominan pada PS 864 (SR) Menginfeksi jagung, sorgum & gulma Dactyloctenium aegypticum Ditularkan via pisau potong, luka dan stek batang/cutting cane Persebarannya cepat Incidence lebih banyak pada irrigated land dari pada rain fed land CP gene partial 98% SCSMV isolat Pakistan Sugarcane Streak Mosaic Virus

(1) Mencari metode deteksi virus pada bibit/cutting cane yang cepat dan mudah diterapkan untuk deteksi rutin (2) Menentukan thermal inactivation point (TIP) sebagai dasar untuk mengeliminir virus secara fisik (3) Mengkaji aspek pemupukan dan cekaman air terhadap perkembangan penyakit

1. Deteksi dengan RT-PCR ASPEK PENTING PREPARASI TEMPLAT PCR PCR : powerful tool dalam deteksi asam nukleat Ekstraksi asam nukleat untuk PCR bervariasi tergantung spesies tanaman, kultivar, tipe jaringan, dan tipe asam nukleat Penghilangan komponen penghambat Reverse Transcriptase atau enzim DNA polymerase PENTING

Faktor yang mempengaruhi pelepasan RNA dari jaringan tanaman ; > Kandungan fisik, kimia serta distribusi virus dalam jaringan tanaman Ekstraksi asam nukleat sulit dan merepotkan Pengembangan dan identifikasi RT-PCR protokol yg mudah, Reliable dan adaptable untuk diagnosis rutin

Rapid detection method Tube Capture -TC Preparasi RNA Total Simple Direct Tube-SDT Glycine Extraction-Gly RNA kit (pembanding)-Q Konstruksi cDNA DNA Amplifikasi/PCR Rapid detection method Visualisasi DNA cDNA – d(T)20 RT-PCR – SCSMV 547F & SCSMV-AP3

Sap cDNA* SDT TC Sap in tube PCR Inkubasi T-ruang 15 min 10.000 rpm, 10’ Washing…1xPBST Supernatant + 30ul DDW, 15U RNAseIn Inkubasi 95ºC, 1 min Inkubasi T-37ºC, 3 hr Washing…1xPBST * Sesuai dengan rekomendasi NEB cDNA*

Sap + RLT Vortex 2 min, 15.000 rpm Supernatan + ETOH Total RNA cDNA* Glycine std Sap + PCI 13.000 rpm, 5’ (2 kali) Presipitasi 13.000 rpm, 10’ Pencucian pelet RNA QIAGEN Sap + RLT Vortex 2 min, 15.000 rpm Supernatan + ETOH Resuspensi dgn DDW * Sesuai dengan rekomendasi NEB Total RNA cDNA*

2. Penentuan TIP & Aplikasinya pada bibit tebu Tujuan : mengetahui suhu yg diperlukan untuk menginaktifkan virus 2.1. Penentuan TIP pada tanaman indikator Sap tanaman sakit Perlakuan panas, 10 menit (50-65ºC dengan interval 5ºC) Inokulasi tanaman indikator (Dactyloctenium aegypticum) Observasi sampai max 4 MSI Deteksi dengan RT-PCR 2.2. Aplikasi TIP pada bibit tebu/bagal Diketahui TIP yang efektif untuk mengeliminir virus pada bibit

3. Kajian aspek budidaya terhadap perkembangan penyakit 3.1. Pemupukan (Field Trial) Perlakuan : Petak utama dosis pupuk N : 0, 3, 6, 8, 10 ku ZA/ha Anak petak dosis pupuk K : 0, 1, 2, 3 ku KCl/ha Dosis P semua perlakuan 1 Ku SP-36/ha Inokulasi Tebu Tiap plot : 2 BST, metode Sein : PS 864 : 10 juring @ 6m, 20 bagal (3 mata/bagal), 3 ulangan/perlakuan Rancob : Rancangan acak split plot & DMRT

3.2. Cekaman air (Percobaan rumah kaca) Perlakuan : 100% kapasitas lapang (sawah) 70% kapasitas lapang (lahan kering masih ada air) 40% kapasitas lapang (lahan kering) Tebu : PS 851, PS 864, PS 921, PSJT 94-33, PSCO 90-2411 Tiap perlakuan diulang 5 kali Inokulasi : umur 2 bulan, Metode Sein

1. EKSPLORASI METODE EKSTRAKSI RNA TOTAL SCSMV 547F HC- PRO 6 K 1 6 K 2 AAAAA… P1 P3 CI VPg NIa NIb CP AP3 500 bp SDT TC Gly Q Q 500 bp Metode SDT dengan modifikasi minor merupakan metode ekstraksi yang mudah, cepat, murah dan terbaik dalam menyediakan templat RNA untuk RT-PCR

METODE SDT UNTUK EKSTRAKSI RNA TOTAL DARI BATANG DAN PELEPAH TEBU 1. 2. 3. 4. Kontrol daun (+) Pelepah Batang atas Batang bawah 500 bp L100 1 2 3 4 Metode SDT dapat dimanfaatkan deteksi batang induk (asymto- matic)/gejala laten sebelum diperbanyak secara luas untuk produksi stek/bagal bebas virus

MODIFIKASI SDT UNTUK EKSTRAKSI DAN DETEKSI SCSMV Standard 1. Daun : PBST = 1:1 2. Inkubasi sap 15 menit 3. Konstruksi cDNA & PCR > 100 mM DTT > RT pada suhu 37°C > Primer 25 uM > Taq 0.5U/25 ul Modifikasi 1. Daun : PBST = 1:6 2. Inkubasi sap 20 menit 3. Konstruksi cDNA & PCR > 50 mM DTT > RT pada suhu 42°C > Primer 10 uM > Taq 1.25U/25 ul

PERBANDINGAN METODE EKSTRAKSI No Parameter Qiagen Kit SDT TC Standard 1. 2. 3. 4. 5. 6. Kemudahan Pengerjaan Waktu/10 sampel Simplicity Reliable Kontaminasi Cost *** 1 jam ** **** < 1 jam * 4.5 jam 2 jam Qiagen RLT/RLC RW1 RPE 2 column SDT - PBST 8 g NaCl 0.2 g KH2PO4 1.15 g Na2HPO4 0.2 g KCl Bufer-TC 1 x PBST 2% PVP Bufer Glycine 0.5 M Glycine 0.5 M NaCl 5 mM EDTA 20% SDS 5% Bentonite PCI

2.1. Titik Panas Inaktivasi SCSMV Pada D. aegypticum Hasil deteksi RT-PCR L100 50°C 55°C 60°C 65°C TIP SCSMV antara suhu 55-60ºC

2.2. Aplikasi TIP untuk Eliminasi SCSMV dari Stek Tebu Perlakuan Panas ∑Tan. Tumbuh/∑Tan Uji ∑Tan.bergejala /∑Tan Uji Keparahan SR-55°C (10’) SR-55°C (30’) SR-55°C (60’) SR-55°C (120’) 37°C-55°C (10’) 37°C-55°C(30’) 37°C-55°C (60’) 37°C-55°C (120’) SR-60°C (10’) SR-60°C (30’) SR-60°C (60’) SR-60°C (120’) 37°C-60°C (10’) 37°C-60°C (30’) 37°C-60°C (60’) 37°C-60°C (120’) K-SR K-37°C 9/10 7/10 0/10 10/10 9/10 4/10 - 6/10 5/10 10/10 ++ +, 3/10 (TB) - ++, 3/10 (TB) +, 2/10 (TB) + +++ SR, suhu ruang TB, tidak bergejala (-), stek mati (+), gejala ringan (++), gejala sedang (+++), gejala parah Hot Water Treatment (HWT) > 30 menit : stek mati Perlu optimasi lamanya HWT pada suhu 55°C (10 min <t<30 min) Pada HWT 55°C, preheat 37°C tidak memberikan pengaruh nyata

6 MST 14 MST A. C. B. D.

3. Kajian aspek budidaya terhadap perkembangan penyakit 3.1. Pemupukan (Field Trial) Pupuk ZA vs Parameter produksi & incidence SCSMV Perlakuan Pengaruh Pupuk ZA ∑Rumpun ∑Tunas Tinggi (cm) KP (%) ZA0 ZA3 ZA6 ZA8 ZA10 15.67a 17.92b 20.00c 21.17cd 21.92d 38.75a 63.33b 63.00b 64.41b 64.00b 25.95a 47.40b 55.55c 61.28d 61.70d 3.11a 10.10b 13.13bc 15.34c 14.55c ZA nyata meningkatkan parameter produksi & incidence SCSMV

Perlakuan Pengaruh Pupuk K ∑Rumpun ∑Tunas Tinggi(cm) KP (%) K0 K1 K2 Pupuk K vs Parameter produksi & incidence SCSMV Perlakuan Pengaruh Pupuk K ∑Rumpun ∑Tunas Tinggi(cm) KP (%) K0 K1 K2 K3 19.67a 19.13a 19.40a 58.40a 59.20a 59.27a 57.93a 49.46a 50.43a 51.48a 50.14a 8.96a 12.08b 11.86b 12.15b K tidak nyata berpengaruh pada parameter produksi, tapi Meningkatkan incidence SCSMV Dugaan ; lokasi percobaan jenuh K

Interaksi Pupuk ZA & K vs parameter produksi & incidence SCSMV Per- lakuan ZA0K0 ZA0K1 ZA0K2 ZA0K3 ZA3K0 ZA3K1 ZA3K2 ZA3K3 ZA6K0 ZA6K1 ZA6K2 ZA6K3 ZA8K0 ZA8K1 ZA8K2 ZA8K3 ZA10K0 ZA10K1 ZA10K2 ZA10K3 Pengaruh Pupuk ZA dan K ∑Rumpun 17.33bc 15.00a 14.00a 16.33a 16.67b 19.00bcd 18.33bcde 17.67bcd 21.00cde 19.33bcde 18.67bcde 22.67e 21.33e 19.67bcde 20.67bcde 23.33e ∑Tunas 39.67a 35.00a 38.67a 41.67a 59.00b 68.33b 63.67b 62.33b 66.00b 63.00b 62.67b 60.33b 64.67b 68.00b 62.00b 64.33b 65.00b 63.33b Tinggi(cm) 24.73a 25.20a 26.87a 27.00a 45.27b 48.00b 49.40b 46.93b 55.80c 55.47c 59.27cd 51.67c 60.97e 61.30e 60.50de 62.37e 60.53e 62.17e 61.37e 62.73e KP (%) 1.90a 5.67c 2.63a 2.23a 3.80b 11.60d 9.70d 15.30d 9.40c 15.77d 14.43d 13.07d 16.33d 11.73d 17.67d 13.37d 15.63d 14.83d 14.37d ZA : parameter produksi & incidence SCSMV ZA > 3 ku/ha tidak nyata ∑rumpun, & tunas, tapi nyata meningkatkan tinggi tanaman > K jenuh di lokasi penelitian Perlu optimasi lebih lanjut Rekomendasi spesifik Lokasi

3.2. Pengaruh Cekaman Air Terhadap Incidence SCSMV Perlakuan ∑Tanaman bergejala/ ∑Tanaman uji tiap klon Masa Inkubasi (Hari) PS 851 PS 864 PS 921 PSJT 941 PSCO 902 KL 40% KL 70% KL 100% 1/5 2/5 3/5 4/5 5/5 14-30 10-30 Air meningkatkan kerentanan tebu thdp SCSMV pada beberapa klon, namun sifat genetik klon juga berperan Note : PSCO 902 – tahan PS 851 - moderat PS921, PSJT 941 – rentan PS 864 – sangat rentan

Percobaan Pemupukan

Percobaan Cekaman Air

Metode ekstraksi SDT merupakan metode yang terbaik dalam menyediakan templat RT-PCR untuk deteksi SCSMV SDT dapat diandalkan untuk digunakan dalam deteksi rutin karena simple, mudah, murah dan konsisten TIP SCSMV berkisar 55-60°C, namun perlu optimasi pada lamanya waktu perlakuan untuk aplikasi pada stek/bagal tebu Pemupukan (ZA) berpengaruh tidak hanya pada parameter pertumbuhan, tetapi juga incidence SCSMV Rekomendasi pemupukan sebaiknya spesifik lokasi Cekaman air meningkatkan kerentanan tanaman terhadap SCSMV

RENCANA PENELITIAN TAHUN KE-3 1. Konstruksi rekombinan CP dan produksi antisera SCSMV untuk tujuan deteksi serologi 2. Eksplorasi bakteri endofit dan PGPR asal tanaman tebu untuk pengendalian biologi SCSMV