KULTUR PROTOPLAS

PROTOPLAS DEFINISI Merupakan sel yang telah kehilangan dindingnya Mudah pecah Dari dari kata Yunani “protos” yang berarti pertama dan “plasma” yang berarti “cairan” Terdiri dari inti, membran sel dan sitoplasma

Merupakan substansi dasar kehidupan yang terdapat pada semua sel makhluk hidup yang memegang peranan penting dalam proses biosintesa dan bioenergi. Terdiri atas dua komponen utama, komponen anorganik dan  komponen organik. Komponen-komponen anorganik terdiri atas air, garam-garam mineral, gas oksigen, karbon dioksida, nitrogen, dan ammonia. Komponen organik terutama terdiri atas karbohidrat, lipida, protein, dan beberapa komponen-komponen spesifik seperti enzim, vitamin, dan hormon.

PERMASALAHAN 1. Penghilangan dinding sel, dinding sel yang harus dihilangkan pada isolasi protoplas umumnya terdiri dari suatu senyawa yang komplek. 2. Protoplas yang sudah tidak berdinding akan menghadapi perubahan tekanan osmose yang sangat drastis dan berbeda dengan lingkungan semula, sehingga didalam medium untuk isolasi maupun budidaya harus ditambahkan zat anti blasting untuk mencegah pecahnya protoplas. Biasanya digunakan sorbitol atau mannitol (0,5 - 0,7) M 3.Protoplas sebagai sel telanjang harus tetap mampu mengadakan reproduksi, dan pada waktunya harus dapat membentuk dinding selnya kembali apabila dibudidayakan pada medium yang sesuai 4. Untuk mendapatkan protoplas yang maksimal, diperlukan bahan tanam atau eksplan yang cocok

5. Harus hidup 6. Pemeriksaan terhadap protoplas yang viable/aktif mengadakan metabolisme 7. Tanaman/ bagian tanaman yang baik ? 8. Permasalahan pemakaian enzim 9. Mengusahakan agar tidak pecah 10. Bagaimana car purifikasi

Protoplas hidup Utuh, Viable, Sebanyak-banyaknya Viable Protoplas utuh, hidup , berfungsi normal, mampu mengadakan pembelahan, pembentukan dinding, dapat tumbu dan berkembang

Dibuat larutan induk dari FDA dengan kadar larutan 1 – 5 mg dalam aceton, kemudian disimpan dalam temperatur 0°C dengan kondisi gelap Ambil larutan 1 tetes dan dicampurkan dalam larutan pencucian (CPW 13 m) Campur larutan FDA yang baru, dalam volume yang sama dengan suspensi protoplas yang telah berada dalam medium budidaya. Setelah 5 menit, diperiksa dalam mikroskop fluerescensi. ( jumlah protoplas yang berfluoresensi x total ) x 100%

MEDIUM CPW KH2PO4 KNO3 CaCl2.2H20 MgSO4.7H2O KJ CuSO4.5H2O 27,3 mg/l 101,0 mg/l 1480,0 mg/l 246.0 mg/l 0,16 mg/l 0,125 mg/l pH 5,8 TAMBAHAN mannitol 13%

Tanaman bagian mana yang baik Diambil dari green house ( dinding tidak tebal) Direkomendasikan dari mesofil daun, walaupun semua bagian tanaman yang hidup bisa digunakan Pemakaian enzim Enzim apa yang paling baik digunakan Pemakaian enzim tunggal atau kombinasi Berapa lama dalam larutan enzim pH dan temperatur berapa? Dilakukan perendaman pada kondisi gelap/ terang? Bagaimana cara mensterilkan enzim yang termolabil ini?

ISOLASI PROTOPLAS DAPAT DILAKUKAN 2 CARA 1. MEKANIK Memotong eksplan didalam larutan plasmolitikum. Protoplas akan mengkerut, sehingga dapat ditekan keluar dari dinding sel. Deplasmolisis selanjutnya akan menyebabkan terlepasnya protoplas dari sel. Kelemahan penggunaan teknik ini adalah relatip sukar, jumlah protoplas yang dihasilkan tidak banyak, keefektifannya dibatasi hanya pada sel-sel yang dapat diplasmolisa Kelebihannya dapat meniadakan efek dari aktifitas ensim yang kadang-kadang merusak atau mengganggu metabolisme yang sangat komplek didalam protoplas.

2. KIMIA SELULOSA Cellulase Onozuka R-10 Cellulysin Driselase Meicelase PECTIN Pectinase Pectyolase Y-23 Macerase Macerozym R-10 Pectinol HEMOSELULOSA Rhozyme HP150 Hemiselulase

PERSIAPAN MACAM EM Cellulase Rhozym Dricellase Pectinase Cellulase Onozuko Macerozim onozuko Mannitol MES (Monopholino-Ethana-Sulfoxida) pH 2,0 – 2,5% 0,1 – 0,5% 500 mg/l 50 mg/l 450 mg/l 250 mg/l 5,8 MENYIAPKAN ELUTION MEDIUM/ EM Campuran larutan enzim untuk maserasi jaringan tanaman terlepas dari sel tunggal, kemudian melarutkan dinding sel yang tersisa Biasanya digunakan pectinase, pectyolase atau macerozym, selulase.

Enzim bersifat termolabil Sterilisasi enzim Enzim bersifat termolabil Tidak diautoklaf, distreilisasi dengan molopore filters (MF) diameter 0,22-2,24 mikron/ 0,24-0,45 mikron Mf ada 2 macam yaitu disposible millipore filters sekali pakai & autoclave millipore filters (dipakai berulang-ulang, disterilkan dg autoklaf setiap akan dipakai) Cellulase (dg variasi konstan) Macerosym (dengan kadar konstan) Mannitol Air 0,6 – 2,5% 0,1% 11% 50 ml

PLASMOLYZING AGENT OSMOLYTIC STABILIZER MEMBRAN STABILIZER FUNGSI UNTUK MENDAPATKAN PROTOPLAS YANG UTUH DAN MASIH BERFUNGSI MANNITOL 10-13% MANNITOL + SORBITOL 0,3-0,5 % CaCl2.2H2O Na2PO4.2H2O MES/ Morpholine ethana sulfonic acid pH 5,0 mM 0,7 mM 3,0 mM 5,8

MEDIUM PENCUCI Mannitol CaCl2.2H2O Air Kelapa 0,25 M 0,10 M 100,00 ml KH2PO4 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.2H2O KJ CuSO4.5H2O Mannitol 27,20 mg/l 101,00 mg/l 1480,00 mg/l 246,00 mg/l 0,16 mg/l 0,0025 mg/l 11%

PURIFIKASI MEDIUM/ PM MEDIUM PEMISAHAN PROTOPLAS DARI KOTORAN/ DEBRIS (PECAHAN TRACHEIDA, TRANCHEA, KRISTAL-KRISTAL, PROTOPLAS YANG PECAH, DLL.) SAKHAROSA pH 102,7 g/l 5,8