Ukuran DNA dapat ditentukan dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesis Gel Agarosa Gel electrophoresis merupakan teknik yang digunakan secara luas untuk analisis DNA dan protein. agarosa gel electrophoresis rutin digunakan untuk preparasi dan analisis DNA. Gel electrophoresis adalah prosedur yang memisahkan molekul berdasarkan kecepatan gerakan melalui gel di bawah pengaruh medan listrik. agarosa gel electrophoresis dapat digunakan untuk menentukan adanya dan ukuran produk PCR.

+ - DNA H  O2  Power • DNA : bermuatan negatip. • Jika ditempatkan di dalam suatu medan listrik, DNA akan bergerak ke arah kutub positip (anoda) . H  O2 • Gel agarosa digunakan untuk memperlambat gerakan DNA dan memisahkan berdasarkan ukurannya. + - Power Scanning Electron Micrograph gel agarosa (1×1 µm)  • Polimer agarosa berlubang, memungkinkan gerakan DNA

+ - Kecepatan Gerak DNA ? DNA small large Power Kekuatan medan listrik, buffer, densitas gel agarosa, ukuran DNA menentukan kecepatan gerak DNA DNA kecil bergerak lebih cepat dari pada DNA besar …gel electrophoresis memisahkan DNA menurut ukuran DNA + - Power small large Di dalam gel agarosa, DNA linear bergerak berbanding terbalik dengan log10 bobot molekulnya.

Agarosa : polimer linear yang diekstrak dari rumput laut D-galactose 3,6-anhydro L-galactose gel agarosa yang manis dimakan sejak abad 17. Agarosa pertama digunakan di biologi ketika Robert Koch menggunakannya sebagai medium kultur untuk bakteri Tuberculosis pada tahun 1882 *Lina Hesse, technisi , kolega Koch yang pertama kali menyarankan agar untuk digunakan dalam pembiakan bakteri Agarosa : polimer linear yang diekstrak dari rumput laut

Pembuatan Gel agarosa

agarosa gel disiapkan dg pencampuran bubuk agarosa dan larutan buffer erLenmmeyer untuk pendidihan agarosa

Alat Electrophoresis Power supply  tutup tanki gel  Kabel listrik  Nampan cetakan  Sisir gel

Nampan cetakan gel & sisir

Persiapan nampan cetakan Segel ujung nampan cetakan dan pasang sisir. Tempatkan nampan cetakan pada permukaan datar. Sisir gel tidak boleh menyentuh permukaan nampan.

agarosa Larutan Buffer Campur bubuk agarosa dan larutan buffer. Gunakan erlenmeyer dg ukuran beberapa kali lebih besar dari volume buffer.

Pelelehan agarosa agarosa tidak larut pada temperatur kamar (kiri). Larutan agarosa dididihkan sapai jernih (kanan). Aduk pelan larutan secara periodik ketika pemanasaan agar semua butiran agarosa larut. ***Hati-hati ketika mendidihkan - lar. agarosa bisa mjd superheated dan bisa mendidih dg hebat jiks dipanaskan terlalu lama di dalam oven microwave.

Penuangan gel Biarkan lar. agarosa agak dingiin (~60ºC) dan kemudian tuang hati-hati larutan agarosa ke dalam nampan cetakan. Hindarkan gelembung udara.

Setiap sisir gel harus di bawah permukaan laruatn agrosa cair

Ketika dingin , tjd poimerisasi agarosa , membentuk gel lunak Ketika dingin , tjd poimerisasi agarosa , membentuk gel lunak. Gel kelihatan jernih jika pendinginan sempurna (30-45 minutes). Hati-hati memindahkan sisir dan plester.

Tempatkan gel di dalam electrophoresis chamber.

DNA buffer   wells    Anode (positive) Cathode (negative) Tambah buffer electrophoresis secukupnya untuk menutup gel dg kedalaman sekurang-kurangnya 1 mm. Pastikan setiap sumur terisi buffer.

Preparasi Sampel Campur sampel DNA dg buffer loading 6X. (w/ zat warna). Ini akan menjadikan sampel kelihatan ketika loading pada gel, dan menaikkan densitas sampel, sehingga tenggelam ke dasar sumur gel. Buffer loading 6X   Bromophenol Blue (pewarna)  Glycerol (pemberat)

Loading Gel Hati-hati tempatkan ujung pipet ke sumur dan masukkan sampel pelan. Sampel seharusnya tenggelam ke dasar sumur. Jangan sampai gel rusak kena ujung pipet.

Runing Gel Tempatkan tutup pada chamber electrophoresis , sambung kabel listrik, hubungkan ke power supply. Pastikan kabel tersambung secara benar sehingga DNA bergerak ke anoda.( merah). Jika power on, akan ada gelembung di dalam elektrode .

Cathode (-)  wells  Bromophenol Blue Gel Anode (+) DNA (-)  Setelah arus diberikan , pastikan Gel berjalan ke arah yg benar. Bromophenol blue akan berjalan ke arah yg sama dg arah DNA.

DNA Ladder Standard -  100  200  300  1,650  1,000  500  850  650  400  12,000 bp  5,000  2,000 DNA migration Note: bromophenol blue bermigrasi pada kecep yg sama yaitu molekul DNA 300 bp bromophenol blue + Penyertaan DNA ladder (DNA yg diketahui ukurannya) pada gel membuat mudah menentukan ukuran DNA yg tidak diketahui ukurannya.

Pewarnaan Gel • Etidium bromida mengikat DNA dan terjadi fluoresensi pada sinar UV, menjadikan visualisasi DNA pada Gel. • Etidium bromida dapat ditambahkan ke gel dan /atau running buffer sebelum gel di run atau gel dapat diwarnai setelah di run. ***Perhatian ! Etidium bromide : mutagen kuat racun sedang. Gunakan sarung tangan.

Alternatif yg lebih aman pengganti Etidium Bromida  Methylene Blue  BioRAD - Bio-Safe DNA Stain Ward’s - QUIKView DNA Stain Carolina BLU Stain …dll keuntungan murah Kurang beracun Tidak perlu sinar UV Tidak menghasilkan limbah Kerugian Kurang sensitif DNA yg dibutuhkan lebih banyak Waktu lebih lama

Pewarnaan Gel • Tempatkan gel di dalam nampan pewarnaan yg mengandung zat warna encer hangat . • Biarkan gel berwarna selama 25-30 menit. • Utk menghilangkan kelebihan pewarna , biarkan gel di dalam air, Ganti air beberapa kali.

Etidium Bromida memerlukan sinar UV utuk visualisasi

Visualisasi DNA (etidium bromida)  100  200  300  1,650  1,000  500  850  650  400 5,000 bp  2,000 DNA ladder  1 2 3 4 5 6 7 8 wells + - - + - + + - Samples 1, 4, 6 & 7 DNA

Visualisasi DNA ( Zat warna QuikVIEW ) DNA ladder  sumur  2,000 bp  1,500  1,000  750  500  250 + - - - - + + - - + - +