MATA KULIAH TEKNOLOGI FERMENTASI (PENGEMBANGAN GALUR) JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN UNIVERSITAS PADJADJARAN

TEKNOLOGI FERMENTASI Mikroorganisme Pengembangan Galur Substrat Metabolit Primer & Sekunder Manfaat yang besar dalam berbagai bidang kehidupan, seperti : kesehatan, produksi pangan, industri dll Kelemahan : Jumlah terbatas Pengembangan Galur

TUJUAN PENGEMBANGAN GALUR Waktu fermentasi lebih singkat Adaptasi yang tinggi dengan proses fermentasi Tidak membentuk busa Tingkat produksi lebih tinggi TUJUAN PENGEMBANGAN GALUR Tingkat konsumsi oksigen lebih rendah Tidak menghasilkan produk yang tidak diinginkan Penggunaan substrat lebih murah

Sel Asam nukleat : PENDAHULUAN DNA (Deoxirybo Nuclei Acid) RNA (Rybo Nuclei Acid)

SEL Sel merupakan unit terkecil dalam organisme hidup, baik dalam dunia tumbuhan maupun hewan. Sel terbagi menjadi 2 macam : Eukariot Prokariot Archea

Struktur sel

Basa purin dan basa pirimidin Asam Nukleat Nukleoprotein Protein Asam nukleat Nukleotida Asam fosfat Basa purin dan basa pirimidin Pentosa

Asam Nukleat Nukleotida Fosfat – Gula – basa nitrogen DNA Purin : Adenin (A), Guanin (G) Pirimidin : Timin (T), Sitosin (C) RNA Purin : Adenin (A), Guanin (G) Pirimidin : Urasil (U), Sitosin (C)

Perbedaan DNA & RNA DNA Bagian pentosa DNA adalah deoksiribosa Bentuk molekul DNA adalah double stranded / double heliks (heliks ganda) Urutan basa yang berbeda (A dan T, G dan C) RNA Bagian pentosa DNA adalah ribosa Bentuk single stranded (untai tunggal yang terlipat sehingga menyerupai heliks ganda Urutan basa yang berbeda (A dan U, G dan C) Jumlah guanin pada molekul RNA tidak perlu sama dengan Cytosin, demikian pula Urasil tidak perlu sama dengan Adenin

Transkripsi Pembuatan RNA dengan menyalin basa DNA (ekspresi genetik) Perubahan basa Timin menjadi Urasil Berlangsung dalam mitokondria RNA terbagi menjadi 3 bagian, yaitu tRNA,rRNA dan mRNA

Translasi Proses sintesis polipeptida dari mRNA Translasi melibatkan ribosom sebagai tempat penggabungan asam amino-asam amino menjadi polipeptida tRNA sebagai pembawa asam amino ke ribosom dan "penerjemah" sandi genetika mRNA Antibiotika dapat menghambat atau menghentikan proses translasi pada biosintesis protein; contohnya antibiotika anisomycin, cycloheximide, chloramphenicol, dan tetracycline.

ISTILAH Mutasi Mutan Mutagen

MUTASI GENETIK Perubahan dalam kromosom yang diturunkan kepada generasi penerusnya Terjadi perubahan rangkaian nukleotida Terjadi secara spontan dan terus menerus dengan laju lambat

Proses – proses mutasi Transisi : penggantian satu basa purin dengan basa purin lainnya atau pirimidin dengan pirimidin lainnya

Transversi : penggantian satu basa purin dengan pirimidin atau sebaliknya pada pada pasangan basa molekul

Mutasi Frame-shift :

Mutagen Radiasi sinar ultra violet (UV) dengan λ 200 – 300 nm terutama pada λ 254 nm, menyebabkan : pembentukkan dimer, transisi, transversi dan frame-shift.

Radiasi ion dengan sinar X, gamma dan Beta Penyebab ionisasi pada medium Bersifat lebih kuat dari radiasi UV sehingga dapat menempuh sel yang tebal Tingkat kerusakan yang besar

Mutagen Kimia Mempengaruhi DNA non-replikasi Hidroksilamin, menyebabkan mutasi transisi Komponen alkilasi (EMS, MMS, DES, DEB, NTG, NMU dan gas mustard), menyebabkan transisi, transversi dan frame-shift.

c. Asam nitrit, menyebabkan deaminasi adenin menjadi hipoksantin dan sitosin menjadi urasil

Analog basa, dapat menggantikan komponen Timin dan Adenin dalam DNA replikasi Mutagen frame-shift : Menyisip diantara dua basa yang bersebelahan dalam utas DNA Menghasilkan protein yang salah Contoh : pewarna akridin orange, proflavin dan akriflavin

Perbaikan mutasi 1. Perbaikan bebas kesalahan Fotoreaktivasi ( mekanismenya memutuskan ikatan kovalen basa) Perbaikan eksisi ( mekanismenya dengan menyambungkan DNA yang rusak dengan enzim polimerase dan ligase) Rekombinasi postreplikatif ( mekanismenya DNA yang rusak akan menghasilkan DNA tiruan yang memiliki celah setelah duplikasi dan ditutup dengan bantuan enzim polimerase)

Perbaikan SOS (terjadi pada DNA dengan kerusakan tinggi, membentuk DNA baru yang tidak sama dengan DNA induk, melibatkan DNA polimerase dan DNA sintetase) Perbaikan adaptif ( dilakukan pada DNA rusak akibat proses alkilasi konsentrasi sub letal)

2. Perbaikan tidak bebas kesalahan Bagian DNA yang sudah diperbaiki dengan komponen yang tidak sama dengan komponen yang hilang

SELEKSI MUTAN Karakteristik mutan yang diharapkan : Galur murni Produksi sel vegetatif dan spora atau unit propagasi yang baik Mudah tumbuh subur dengan fase lag yang pendek Menghasilkan produk tunggal dalam jumlah banyak Mudah dipanen Bebas senyawa toksin Dapat menghasilkan produk metabolit dalam waktu singkat Dapat tumbuh dalam kondisi ekstrim Sifat genetik yang stabil Awet dan dapat disimpan janka waktu lama

Cara seleksi mutan Seleksi secara acak dilakukan pada kondisi fermentasi skala industri, namun biayanya mahal Isolasi secara selektif : isolasi mutan resisten isolasi mutan auksotrop Isolasi berdasarkan penampakan koloni

REKOMBINASI Rekombinasi pada bakteri : Transformasi (pemutusan fragmen kromosom maupun plasmid sel donor dan bergabung dengan fragmen kromosom maupun plasmid dari sel penerima) Transduksi (pemindahan DNA dari satu bakteri ke bakteri lain dengan bantuan virus) Konjugasi (pemindahan episoma dari sel donor ke sel resipien)

Transduksi

Siklus seksual pada Kapang Rekombinasi pada Kapang Siklus seksual pada Kapang

Siklus paraseksual

Rekombinasi Penggabungan Protoplasma, dengan tujuan : 1. Rekombinasi interspesifik antara galur seksual dan paraseksual 2. Hibridisasi interspesifik untuk memperoleh mikroba baru 3. Transfeksi atau transformasi protoplas (kloning DNA)

REGULASI

Mekanisme induksi enzim (tidak terdapat inducer) O S DNA represor RNA polimerase

Mekanisme induksi enzim (terdapat inducer) O S DNA Transkripsi RNA polimerase Translasi represor Represor Enzim inactive inducer

Mekanisme feed back represion (tanpa co represor) DNA Transkripsi RNA polimerase Translasi aporepresor Enzim

Mekanisme feed back represion (terdapat co represor) DNA represor RNA polimerase Corepresor aporepresor corepresor

Rekayasa Genetik Mikroba Tak Terarah untuk Kegiatan Industri Dapat dilakukan melalui mutasi menggunakan agensia mutagenik atau radiasi UV Contoh: Pengembangan Penicillium penghasil penicillin yang tinggi Dapat dilakukan melalui fusi protoplas antar jasad yang secara filogenetik berjauhan hubungannya; sering digunakan pada rekayasa genetik khamir (yeasts) dan jamur Rekayasa genetik alami Menumbuhkan mikroba dalam keadaan marginal (“stressful”) dan menapis (selecting) galur mikroba baru dengan kemampuan tumbuh yang lebih baik pada keadaan tersebut. Muncul karena mutasi spontan.

Rekayasa Genetik Mikroba Terarah untuk Kegiatan Industri Melalui penyisipan potongan DNA yang mengandung gen menggunakan teknologi rekombinasi DNA untuk menghasilkan produk protein tertentu. DNA hasil rekombinasi dapat dipindahkan ke dalam jasad yang lain untuk menghasilkan sifat yang dikehendaki di jasad tersebut. Gen harus bisa diekspresikan.

Pengendalian Ekspresi Gen Melalui modifikasi pada daerah pengatur transkripsi (transcriptional regulation), memfusikan protein, dan menghilangkan daerah pengatur umpan balik (feedback regulation controls) Cara ini merupakan bagian dari pengendalian jalur metabolisme untuk mengendalikan atau meningkatkan produksi suatu bahan.

Vektor Ekspresi Vektor yang memiliki promoter untuk dapat melakukan transkripsi suatu gen dalam suatu spesies yang dikehendaki.

DNA Rekombinan Kombinasi DNA yang berasal dari dua organisme yang berbeda Bakteri dan manusia Bakteri dan tanaman Virus dan manusia

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein E. coli Informasi genetiknya sudah sangat dipahami Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami Tumbuh cepat dan tidak banyak persyaratan Dapat menerima berbagai vektor, mudah ditransformasi, Protein intraseluler, Produksi protein rendah

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein Bacillus Informasi genetiknya sudah sangat dipahami Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami Tumbuh sangat cepat dan tidak banyak persyaratan Produksi protein tinggi Sulit ditransformasi Protein intraseluler Pilihan vektor terbatas

Bakteri Inang untuk Ekspresi Protein Streptomyces Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami Informasi genetiknya sudah dipahami Tidak banyak persyaratan untuk tumbuh Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Tumbuh lambat Sulit ditransformasi Pilihan vektor terbatas

Khamir Inang untuk Ekspresi Protein Saccharomyces Kemampuannya dalam fermentasi telah sangat dipahami Informasi genetiknya sudah dipahami Tidak banyak persyaratan untuk tumbuh Tumbuh cepat Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Sulit ditransformasi Pilihan vektor terbatas

Jamur Inang untuk Ekspresi Protein Trichoderma Tidak banyak persyaratan untuk tumbuh Produksi protein tinggi Protein ektraseluler Kemampuannya dalam fermentasi belum banyak dipahami Sulit ditransformasi Tumbuh lambat Pilihan vektor terbatas

DNA Rekombinan Kombinasi DNA yang berasal dari dua organisme yang berbeda Bakteri dan manusia Bakteri dan tanaman Virus dan manusia

Penggunaan Mikroba Rekombinan control

Industri Keju: Industri keju memerlukan rennet, enzim protease yang diperoleh dari lambung anak sapi yang masih menyusu dan belum makan rumput. Pada tahun 1960 FAO memprediksi akan adanya kekurangan rennet karena kebutuhan daging dunia mendorong peternak untuk memelihara sapinya hingga dewasa. Usaha untuk mencari enzim protease pengganti rennet dimulai. Chymosin (rennet hasil rekayasa genetika) dihasilkan pada awal tahun 1980an dari mikroba (Escherichia coli, Kluyveromyces lactis dan Aspergillus niger) yang direkayasa. Chymosin telah mengalami pengujian yang ketat untuk menjamin keamanan penggunaannya.

Industri Keju: Chymosin memiliki sifat dan fungsi yang sama dengan rennet yang diperoleh dari anak sapi. Enzim ini dapat digunakan untuk menghasilkan keju yang kualitasnya sama dengan keju yang dihasilkan menggunakan rennet dari anak sapi yang lebih baik daripada jika menggunakan rennet dari jamur atau hewan selain sapi. Chymosin pertama kali digunakan untuk pembuatan keju pada tahun 1988. Pada saat ini hampir 90% rennet dihasilkan dari khamir terekayasa. Penggunaan Chymosin didukung oleh kelompok vegetarian dan kelompok agama yang menolak konsumsi bagian tubuh sapi.

Penggunaan Mikroba Rekombinan (1C) Produksi protein komersial Protein pengobatan Insulin untuk pengobatan diabetes Interferon-gamma untuk pengobatan kanker Faktor VIII untuk pengobatan hemofili Erythropoetin untuk pencairan gumpalan darah