MORFOLOGI BAKTERI DAN JENIS PEWARNAAN BAKTERI

MORFOLOGI BAKTERI Ukuran Bakteri Pada umumnya penampang bakteri adalah 0,7 - 1,5 mikrometer dan panjangnya sekitar 1 - 6 mikrometer

MORFOLOGI BAKTERI Coccus/sferis/bulat

MORFOLOGI BAKTERI Batang/basil Bacillus antraksis Bacillus subtilis Bacillus pumilus

MORFOLOGI BAKTERI Spiral Leptospira

STRUKTUR BAKTERI DAN FUNGSINYA Kapsul Dinding sel Membran sitoplasma Ribosom Sitoplasma Inti sel (nukleoid) Flagela Pili

Kapsul Lapisan tipis diluar dinding sel tersusun atas polisakarida dan atau polipeptida, tidak dimiliki oleh semua bakteri. Fungsi: melindungi bakteri dari fagositosis, penentu virulensi bakteri, bersifat antigenik.

Dinding sel (cell wall) Merupakan lapisan antara membran sitoplasma dengan kapsul. Gram + : peptidoglikan & as.teikoat (LTA) Gram - : peptidoglikan (LPS) & outer membran Berfungsi: mempertahankan bentuk bakteri, memberi perlindungan osmose, menentukan sifat pewarnaan, antigenisitas dan patogenitas bakteri.

Membran sitoplasma (plasma membrane) Tersusun oleh 60% protein dan 40% lipid  posfolipid Fungsi: mengatur keluar masuknya bahan2 dari dalam/luar sel. Bersifat semipermeabel (hanya bahan tertentu yang dapat lewat)  air, as amino, beberapa gula sederhana, bahan larut lemak.

Mesosom Inti sel (nukleoid) Merupakan lipatan (folding) dari membran sitoplasma yang berperan aktif pada proses pembelahan sel dan metabolisme. Inti sel (nukleoid) Tidak memiliki pembungkus inti sebenarnya. Terdapat kromosom sebagai pusat info genetik yang mengatur semua kegiatan sel, seperti metabolisme dan penentu sifat resisten.

Ribosom Merupakan tempat sel membuat atau mensintesis protein. Terdiri dari RNA dan protein. Sitoplasma Terdiri dari 80% air. Selain itu ada asam nukleat, protein, karbohidrat, lipida, ion anorganik dan berbagai senyawa dengan bobot molekul rendah. Tempat cadangan makanan.

Flagela Merupakan alat gerak yang tersusun atas protein (flagelin) Macam flagela : Flagela monotrikus, contoh: Pseudomonas aeruginosa Flagela lopotrikus, contoh: Pseudomonas fluorescens Flagela amfitrikus, contoh: Aquaspirillum serpens Flagela peritrikus, contoh: Salmonella typhosa

Pili Struktur tambahan pada permukaan dinding sel, lebih pendek dan halus dari flagela. Tersusun atas protein (pilin). Fungsi: menempelkan diri pada sel hospes (colonizing factor) dan sebagai pemindahan materi genetik (sex pili)

Spora Merupakan resting cells dan biasa diebut endospora. Terbentuk apabila nutrisi esensial yang dibutuhkan tidak memenuhi kebutuhan untuk pertumbuhan bakteri. Spora dapat tahan bertahun-tahun dan bersifat dormant (hidup, tapi tidak berkembangbiak)

PEMERIKSAAN TIDAK LANGSUNG DENGAN TEKNIK PEWARNAAN Ukuran bakteri sangat kecil dan tipis  struktur bakteri sukar untuk dilihat bagian-bagiannya menggunakan mikroskop  perlu dilakukan penambahan zat warna (pewarnaan bakteri)  terjadi proses pertukaran ion-ion zat warna dengan ion-ion protoplasma bakteri

JENIS-JENIS PEWARNAAN BAKTERI Pewarnaan Sederhana Pewarnaan Gram Pewarnaan Negatif Pewarnaan Tahan Asam Pewarnaan Spora Pewarnaan Kapsul

Pewarnaan Sederhana Satu cara cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum Untuk membedakan berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dsb) Hanya menggunakan 1 macam zat pewarna saja Zat-zat warna pada pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin  sehingga mudah bereaksi dengan sitoplasma bakteri yang bersifat basofil Contoh zat warna yang banyak digunakan: methylene blue, karbol violet, dan air fuchsin

Prosedur Pewarnaan Methylene Blue Dibuat preparat bakteri Warnai dengan methylene blue selama 1-3 menit Cuci dengan air kran, keringkan pada suhu kamar Lihat dengan mikroskop menggunakan minyak imersi Bakteri-bakteri berwarna biru.

Pewarnaan Gram Pertama kali diuraikan dan dipublikasikan oleh seorang ahli bakteriologi Denmark, Hhans Christian Gram pada tahun 1884 Pewarnaan Gram bertujuan untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negatif yang memiliki struktur berbeda terutama pada dinding selnya  memudahkan analisis terhadap suatu bakteri

Pewarnaan Gram Prinsip atau pokok-pokok pewarnaan Gram meliputi 4 tingkatan yaitu: Pewarnaan dengan zat warna utama (kristal gentian violet) Merekatkan (mengintensifkan) dengan suatu larutan mordant, yaitu larutan lugol Menambahkan zat dekolorisasi (bahan peluntur) misalnya alkohol atau alkohol-asam Pemberian zat penutup (counter stain), misalnya larutan fuchsin, safranin, dll

Pewarnaan Gram Prinsip pewarnaan Gram berdasarkan jenis dinding sel bakteri: Gram (+) - Peptidoglikan bakteri yang tebal dan lapisan lemak yang tipis pada dinding bakteri berikatan kuat dengan Gentian Violet - Lugol memperkuat ikatan tersebut, lalu diberikan alkohol sehingga melunturkan lemak - Karena pada bakteri Gram (+) lemaknya tipis sehingga warna ungu pada Gentian Violet yang luntur pun sedikit dan bakteri tetap dipenuhi warna ungu - Karena sudah dipenuhi dengan warna ungu maka tidak bisa lagi berikatan dengan fuchsin

Pewarnaan Gram Prinsip pewarnaan Gram berdasarkan jenis dinding sel bakteri: 2. Gram (-) - Peptidoglikan bakteri yang tipis dan lapisan lemak yang tebal pada dinding bakteri maka saat berikatan dengan Gentian Violet, ikatan yang terjadi adalah ikatan lemah - Diberi Lugol yang memperkuat ikatan tersebut dengan Gentian Violet, namun tidak terlalu memberikan arti yang signifikan - Bakteri Gram (-) yang memiliki lemak tebal ketika diberi alkohol maka lemak luntur dan warna Gentian Violet pun luntur - Karena tidak terwarnai maka bakteri akan menyerap warna fuchsin yaitu merah

Prosedur Pewarnaan Gram Buat preparat melingkar diameter 2-3 cm Fiksasi di atas api sampai kering Genangi Gentian Violet 3 menit, dicuci dengan air Genangi dengan Lugol selama 2 menit Genangi dengan alkohol hingga jernih Cuci dengan air dan genangi dengan fuchsin selama 1 menit, lalu cuci dengan air Keringkan dan periksa di mikroskop pembesaran

Pewarnaan Negatif Bertujuan untuk mewarnai beberapa jenis bakteri yang sulit untuk diamati morfologinya dengan pewarnaan sederhana Pewarnaan dilakukan bukan untuk mewarnai bakterinya namun untuk mewarnai latar belakang dari bakteri  bakteri akan terlihat berwarna bening, latar belakangnya hitam (akibat warna dari tinta cina) Digunakan untuk identifikasi bakteri spirochaetales (Treponema pallidum, leptospira), kapsul pada bakteri tertentu seperti pada Diplococcus pneumoniae, Klebsiella, dll.

Prosedur Pewarnaan Negatif Diteteskan 1 tetes tinta cina pada kaca objek Diteteskan 1 tetes sampel, campur homogen Dibuat apusan sehingga ada bagian tipis Dikeringkan kemudian diperiksa dengan mikroskop

Pewarnaan Tahan Asam (Ziehl-Neelsen) Diuraikan pertama kali oleh dua doktor Jerman yaitu Franz Ziehl (1859-1926) seorang ahli ilmu bakteri dan Friedrich Neelsen (1854-1894) seorang ahli patologi Pewarnaan khusus untuk mengidentifikasi bakteri-bakteri yang memiliki sifat tahan asam khususnya genus Mycobacterium Mycobacterium dikatakan tahan asam sebab jika diwarnai dengan karbol fuchsin, sifat kimianya yang unik menahan zat warna walaupun olesan yang terwarnai telah dicuci dengan alkohol-asam  bakteri tahan asam akan tampak berwarna merah

Prosedur Pewarnaan Tahan Asam (Ziehl-Neelsen) Dibuat sediaan dengan cara coiling ukuran 2x3 cm Sediaan dilewatkan 3x melalui api spiritus Sediaan digenangi dengan karbol fuchsin Dari bawah sediaan dipanasi dengan menggunakan spiritus sampai keluar uap (jangan sampai mendidih) Diamkan minimal 5 menit. Lebih lama diperbolehkan tetapi cat sediaan jangan sampai kering Sediaan dibilas hati-hati dengan air mengalir Sediaan dimiringkan dengan menggunakan pinset untuk membuang air Sediaan digenangi dengan asam alkohol sampai tidak tampak warna merah karbol fuchsin Digenangi methylene blue selama 10-20 detik Sediaan dibilas dengan air mengalir, keringkan sediaan pada rak pengering. Jangan keringkan dengan tisu.

Pewarnaan Spora Bertujuan untuk mengamati dan mempelajari spora yang dimiliki oleh bakteri tertentu Tidak semua bakteri memiliki spora, umumnya bakteri yang berbentuk batang yang bisa menghasilkan spora Spora: alat pelindung yang dikeluarkan bakteri bila keadaan sedang tidak baik untuk dirinya (disebut endospora, karena dihasilkan bakteri di dalam tubuhnya) Pengamatan spora penting karena bakteri yang memiliki spora cukup berbahaya, walaupun tidak semuanya

Prosedur Pewarnaan Cara Klein 1 ml suspensi bakteri umur 24 jam dalam suspensi kuman pada agar-miring yang telah berumur 48 jam, dicampur dengan karbol fuchsin yang sama banyaknya di dalam tabung reaksi Campuran ini direndam pada penangas air 80 °C kira-kira 10 menit (untuk membunuh bakteri-bakteri yang tidak membentuk spora) 1 ose dari campuran dibuat sediaan pada 1 kaca objek yang bersih dan bebas dari lemak Keringkan dan fikasi 3x di atas api bunsen Celupkan dalam asam-sulfat 1% selama 1-2 detik. Cuci dengan air kran dan diwarnai dengan methylene blue kira-kira selama 2-3 menit Cuci dengan air kran, keringkan dan lihat dengan mikroskop. s *Hasil pewarnaan: Spora: berwarna merah Bakteri: berwarna biru

Pewarnaan Kapsul Kapsul tidak mempunyai afinitas yang besar terhadap bahan-bahan zat warna yang bersifat basa Beberapa kapsul dapat dirusak oleh gangguan mekanik atau larut bila dicuci dengan air Kapsul dari berbagai spesies berbeda dalam susunan zat-zatnya  tidak semua kapsul dapat diperlihatkan dalam proses pewarnaan yang sama Contoh bakteri berkapsul: Bacillus anthracis, Diplococcus pneumonia, Klebsiella, dll

Prosedur Pewarnaan Kapsul Diletakkan 1 suspensi bakteri dan 1 ose tinta cina pada kaca objek Campurkan kedua suspensi tersebut hingga menjadi lapisan kaca film tipis Keringkan preparat dan difiksasi 3x Preparat ditetesi dengan zat warna fuchsin selama 5 menit Zat warna kemudian dibuang, tetapi jangan dicuci, kemudian dikeringkan Preparat ditetesi dengan minyak imersi dan diamati di bawah mikroskop.

TEKNOLOGI DNA

Teknologi DNA Rekombinan berdasarkan mekanisme yang ada pada bakteri

Lederberg dan Tatum (1946) Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan bakteri mempunyai mekanisme seksual. Menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. Merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak).

Mekanisme pertukaran gen dan rekombinasi Rekombinasi genetik mengarah pada pertukaran gen antara dua molekul DNA untuk membentuk kombinasi gen baru dalam kromosom. Transfer genetik  transfer gen secara vertikal dan horizontal. Vertikal : gen diturunkan dari satu induk kepada keturunannya. Horizontal : transfer gen antara bakteri satu dengan bakteri lain melalui beberapa cara, yaitu transformasi, konjugasi, dan transduksi.

Transfer Materi Genetik

1. Transformasi Pada proses ini, gen ditransfer dari satu bakteri ke bakteri lain sebagai DNA telanjang dalam larutan. Proses transformasi dapat berlangsung dengan baik bila sel donor & sel resipien memiliki hubungan kekerabatan yang sangat dekat. Saat transformasi berlangsung, sel resipien harus dalam keadaan kompeten (suatu kondisi fisiologis dimana terjadi perubahan struktur pada dinding sel & membran sel)  Sel bakteri resipien menjadi permeabel untuk menerima molekul DNA.

Transformasi Alami Yang secara alami dapat melakukan transformasi yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif, seperti genus Bacillus, Haemophilus, Neisseria, dan Acinetobacter. Kompetensi alami

Transformasi Buatan Proses pembuatan sel menjadi kompeten dapat dilakukan dengan cara merendam sel dalam larutan CaCl. Contoh: E.coli, Salmonella, Pseudomonas.

2. Konjugasi Merupakan proses transfer bahan genetik dari sel satu ke sel yang lain melalui kontak langsung. Konjugasi diperantarai oleh plasmid, yaitu molekul DNA sirkular yang terdapat bebas dalam sel bakteri dan bereplikasi secara independen (tidak tergantung kromosom bakteri). Proses konjugasi pada bakteri gram positif & negatif?

Pada bakteri gram negatif, proses konjugasi melibatkan pili seks yang merupakan perpanjangan dari permukaan sel donor yang akan melekat pada permukaan sel resipien  memperantarai kontak langsung antara sel donor dan sel resipien. Pada bakteri gram positif, proses konjugasi umumnya dalam bentuk kontak langsung antara dinding sel donor dengan dinding sel resipien.

Bakteri gram negatif Bakteri gram positif Proses konjugasi

3. Transduksi Merupakan proses transfer DNA dari sel donor ke sel resipien melalui bakteriofaga (faga). Proses transduksi dibedakan menjadi 2, yaitu : Transduksi non-spesifik (umum)  dapat mentransfer bagian manapun dari DNA donor. Transduksi spesifik (specialized transduction)  hanya mentransfer segmen DNA tertentu  diperantarai oleh faga lisogenik.

Proses transduksi Faga melekat pada sel bakteri & menyuntikkan DNA-nya. Enzim faga mendegradasi DNA bakteri. Sel menyintesis faga baru yg membawa DNA faga & DNA bakteri. Sel lisis, faga lepas dari bakteri yg diinfeksinya & menginfeksi sel bakteri baru. Faga transduksi menyuntikkan DNA donor (gen bakteri donor). DNA donor disisipkan ke kromosom bakteri resipien yg baru.

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN Kumpulan teknik atau metode yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan. (Proses: rekombinasi; Hasil: rekombinan) Teknologi DNA rekombinan meliputi : Teknik untuk mengisolasi DNA. Teknik untuk memotong DNA. Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA. Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan.

Manfaat Teknologi DNA Rekombinan Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat di bidang Teknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat di bidang kesehatan. Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetes. Contoh: Humulin R™ Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis, telah diproduksi secara komersial menggunakan S.cereviciae dalam skala industri. Contoh: HBV

Manfaat Teknologi DNA Rekombinan c. Hormon tumbuh manusia (Growth Hormon) diproduksi menggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan (misal: cebol). Contoh: Omnitrope

Contoh Produk Rekombinan Antibodi rekombinan Protein terapeutik : insulin, interferon, albumin serum manusia, growth hormone, antithrombin, faktor pembekuan darah, gonadotropin manusia. Vaksin : hepatitis B, herpes, influenza, malaria Vaksin DNA Terapi gen Produk pertanian : tanaman tahan penyakit, resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen Produk bioremediasi : pengurai lemak/minyak, penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida.

TERIMA KASIH