Rudi Heryanto Analisis Metabolomik berbasis Spektroskopi Molekular Workshop Metabolomik Rudi Heryanto Analisis Metabolomik berbasis Spektroskopi Molekular R. Sidang Senat Akademik, Ged, AHN Kampus IPB Dramaga Bogor, 30 Oktober 2017 Klaster Riset Metabolomik - DRI Institut Pertanian Bogor

Analisis Klinik Tradisional: Metabolomik … Identifikasi dan kuantisasi sistematis dari semua molekul kecil atau yang relevan secara biologis dalam kompartemen, sel, jaringan atau cairan tubuh tertentu  Analisis global pada tingkat metabolit Analisis Klinik Tradisional: Metabolomics: Sedikit metabolit yang sudah diketahui untuk penyakit( misal glukosa untuk diabetes dll…) Semua metabolit dianalisis secara bersamaan tanpa pengetahuan sebelumnya Claudio Luchinat, CERM, Università di Firenze 2

Metabolomik Apa yang sedang mereka kerjakan? … Identifikasi dan kuantisasi sistematis dari semua molekul kecil atau yang relevan secara biologis dalam kompartemen, sel, jaringan atau cairan tubuh tertentu  Analisis global pada tingkat metabolit Apa yang sedang mereka kerjakan? Claudio Luchinat, CERM, Università di Firenze 3

Metabolomik Hanya analisis pada level global yang dapat menjelaskan keseluruhan cerita Claudio Luchinat, CERM, Università di Firenze 4

Teknologi Metabolomik UPLC, HPLC CE/microfluidics LC-MS/MS FT-MS QqQ-MS NMR spectroscopy X-ray crystallography GC-MS/MS FTIR/UV Vis

Teknologi Metabolomik The Second International Symposium on Temulawak Tahun 2011 Dr. Young Hae Choi, Division of Pharmacognosy, Section Metabolomics Institute of Biology, Leiden University, former associate editor Phytochemical Analysis

Teknologi Metabolomik Teknik Analisis Teknik Tandem Spektroskopi Kromatografi TLC GC LC UV-Vis IR MS NMR CE-MS GC-MS LC-MS Spectral fingerprinting

Spectral fingerprinting (UV-Vis-IR) Spectral fingerprinting merupakan metode cepat dalam mengidentifikasi, membedakan, autentikasi dan klasifikasi (kualitatif) dan kuantifikasi metabolit target dari material biologis seperti obat herbal, metode IDAKK Genetik and faktor lingkungan akan mempengaruhi jalur metabolit sehingga akan menghasilkan pola komposisi metabolit kimia yang berbeda yang menyebabkan variasi dalam fingerprintnya. Fingerprinting dapat membedakan berdasarkan pola secara keseluruhan, identifikasi metabolit spesifik yang menjadi pembeda bukan menjadi tujuan utama untuk ditentukan.

Spectral fingerprinting (UV-Vis-IR) The success of spectral fingerprinting is dependent on the magnitude of the variation in the patterns induced by the experimental factors as compared to the normal variation among individual plants. With proper experimental design and data processing, spectral fingerprinting can be a useful tool for characterizing the sources of variation in plant materials Spectral fingerprints are acquired from solid samples or sample extracts with no prior separation. Consequently, spectral fingerprints are the sum of spectra of every component present. Spectral fingerprinting has been reported using a variety of detectors but primarily those that provide high dimensional data (i.e., many variables per sample) such as UV-Vis, IR, NMR, MS etc. Luthria DL et al. J. Agric Food Chem 56 (2008) 5457

Spectral fingerprinting (UV-Vis-IR)

Spectral fingerprint (UV-Vis-IR) Beberapa keuntungannya: Spektrum UV-Vis dan IR  representasi yang khas dari seluruh metabolit dalam suatu sistem kimia, sehingga dapat digunakan untuk mendiferesiensi dan mengidentifikasi material Dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif Cepat dan nondestruktif Relatif sederhana dan berbiaya rendah

Spectral fingerprint (UV-Vis-IR) Penggunaan spektroskopi UV-Vis dan IR dalam analisis metabolomik untuk IDAKK (kendali mutu): Identifikasi komposisi kimia dalam bahan baku/obat herbal Auntentikasi bahan baku/obat herbal asli dari palsu Diferensiasi bahan baku dari daerah berbeda Identifikasi bahan baku asal budidaya dan liar Identifikasi spesies yang berbeda dari bahan baku Diferensiasi bahan baku berdasarkan bagiannya, lama penyimpanan, fitur morfologi Pengujian kualitas bahan baku akibat pemrosesan Kendali mutu ekstrak, granula, injeksi

UV-Vis-IR: kembali ke dasar 4000 cm-1 (2.5 μm) 200 cm -1 (50 μm) 108 107 106 105 104 103 102 101 1 10-1 10-2 10-3 Frequency (cm-1) -Ray X – Ray Ultraviolet v i s i b l e NIR MIR FIR ESR NMR Region Infrared Microwave Radio, TV Waves Nuclear Transitions Inner Shell Electronic Transitions Valance Electron Transitions Molecular Vibrations Molecular Rotations Spin Orientation in Magnetic Field Interaction Wavelength (m) 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 1 101 Spektrum elektromagnetik Slide Courtesy Bruker Optics

UV-Vis-IR: kembali ke dasar S = k Ca Proses keseluruhan dalam pengukuran menggunakan instrumen

UV-Vis-IR: kembali ke dasar Sistem multikomponen? Hubungan kuantitatif antara sinyal dan analat dapat dinyatakan oleh: Persamaan Lambert-Beer dapat diperluas untuk sampel yang mengandung banyak komponen penyerap. Absorban individual bersifat aditif. Hukum Lambert-Beer A = a.b.C A = .b.C dengan A = absorbans a = absorptivitas  = absorptivitas molar b = sample pathlength Dua komponen n komponen

UV-Vis-IR: kembali ke dasar Campuran atrazin dan dicamba dicamba atrazin

UV-Vis-IR: kembali ke dasar Spektrum UV-Vis Kunyit Spektrum UV-Vis 1: Bisdemethoxycurcumin, 2: Demethoxycurcumin, 3: Curcumin

UV-Vis-IR: kembali ke dasar Typical biological spectrum showing biomolecular peak assignments from 3,000–800 cm−1, where ν = stretching vibrations, δ = bending vibrations, s = symmetric vibrations and as = asymmetric vibrations. nature protocols | VOL.9 NO.8 | 2014

Alur Pengembangan Metode IDAKK Spektrum Sampel Material Biologis Matriks yang kompleks, hanya menyediakan informasi total dari keadaan konstituen yang ada, mengandung pita UV-Vis dan IR yang bertumpang tindih Langkah-langkah dalam mengembangkan metode IDAK tumbuhan obat menggunakan spectral fingerprinting dan kemometrik Pengambilan dan Preparasi Sampel Koleksi dan prapemrosesan sinyal Analisis kemometrik Validasi

Alur Pengembangan Metode IDAKK Data spektrum original Spektrum original dari sampel X Prapemrosesan sinyal, data pretreatment Pemilihan model Set kalibrasi Set validasi Set prediksi The pretreatments and the logical flow of different calibration, validation, and prediction sets Model IDAKK I. C. Yang et al., J. Food Drug Anal. 21 (2013) 268

Alur Pengembangan Metode IDAKK INPUT OUTLIER REMOVAL PREPROCESSING DATA ANALYSIS OUTPUT

Alur Pengembangan Metode IDAKK: INPUT Most overlooked stage of data analysis. Most critical stage of all. Data must be converted or transferred into the analysis software. Proprietary collection software make this task difficult. However, some analysis software have excellent data importing functionality

Outliers – Problems and Removal Alur Pengembangan Metode IDAKK Outliers – Problems and Removal Removing outliers is a delicate procedure. Grubbs test used to detect outliers. Frequently requires knowledge about the process being examined. False outliers, samples at extremes of the system that appear infrequently within the data. These are NOT REMOVED True outliers, samples or variable that is statistically different from the other samples. These ARE REMOVED

Alur Pengembangan Metode IDAKK Preprocessing Preprocessing – Main goal of the preprocessing stage is to remove variation within the data that does not pertain to the analytical information. Near IR Tablet Data 7 6.5 6 5.5 Signal Intensity 5 4.5 4 3.5 600 3 Typical preprocessing methods Baseline Correction Mean Centering Normalization Orthogonal Signal Correction Multiplicative Scatter Correction Savitsky-Golay Derivatisation 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 Wavenumber cm-1 MEAN CENTRING Mean Centred NIR Spectra 0.8 0.6 Mean Centred Signal Intensity 0.4 0.2 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 600 800 1000 1200 1400 Wavenumber cm-1 1600 1800

Alur Pengembangan Metode IDAKK Data Analysis Scores Plot 3 Many different methods for performing multivariate data analysis. Principal Component Analysis 2 Scores on PC 2 (12.88%) 1 -1 -2 Partial Least Squares MCR Neural Networks -3 -15 -10 -5 0 Scores on PC 1 (81.38%) 5 10 60 50 40 30 20 10 4.65 4.7 4.75 4.8 4.85 4.9 4.95 5 5.05 5.1 5.15

Alur Pengembangan Metode IDAKK Output Quantitative Prediction models What is the concentration of the sample?? Calibration and Validations Predictions Prediction Errors RMSEC and RMSEP Qualitative Classification models. Does a sample belong to a group or not?? Calibration and Validations Classifications Classification error Number of samples classified correctly

Contoh Kerangka Pengembangan Metode IDAKK dengan Spektroskopi IR Langkah utama untuk analisis sampel: Preparasi sampel Setting instrumental Pembuatan spektrum Pemrosesan data

Preparasi sampel Semua sampel diperlakukan sama sebelum pengukuran Jumlah sampel minimal 5 per kelompok, semakin banyak semakin baik Sampel dapat berupa serbuk ataupun ekstrak Untuk pengukuran IR dalam bentuk: Pelet KBr Lapisan tipis Larutan Mull (terutama untuk padatan yang tak dapat larut pada pelarut yang biasa digunakan pada IR atau tak dapat dibuat pelet KBrnya, sampel dihaluskan hingga ukuran partikelnya < 2 m dengan adanya nujol)

UV-Vis: transmisi, absorbsi, reflektans Pengukuran spektrum UV-Vis: transmisi, absorbsi, reflektans Tiga mode sampling utama untuk spektroskopi FTIR

Pengukuran spektrum Parameter yang dipertimbangkan dalam pengukuran spektrum Spektrum UV-Vis: - slit width - kecepatan payar (scan) Spektra FTIR: - Fungsi Apodisasi - Resolusi - Jumlah payar (scan)

Pengukuran spektrum Fungsi Apodisasi: Applying some type of function to Fourier transform integration to reduce the ripples Fungsi Apodisasi mempengaruhi resolusi dan tinggi puncak Pilihan paling umum: Happ-Genzel Schematic of Boxcar Truncation of the interferogram for a single frequency source

Pengukuran spektrum Resolusi Spektra The spectral resolution is related to the travel of the moving mirror. To resolve two bands in the spectrum, the mirror must travel to complete one beat pattern generated between the two cosine waves in the interferogram that represent the wavenumber portions of the spectrum It indicates the degree of fineness of the data obtained by measurement (i.e., the minimum peak interval that can be distinguished). For example, if 4 cm-1 is selected, spectra will be obtained at intervals of approximately 2 cm-1. To obtain sharper spectra (i.e., spectra with a higher resolution), a value such as 2 cm-1 or 1 cm-1 is set. The resolution can be set to values such as 16 cm-1, 8 cm-1, 4 cm-1, or 2 cm-1 At higher resolutions (2 cm-1) you will see more noise in the spectrum than at a lower resolution (8 cm-1). Untuk padatan cairan biasanya cukup menggunakan 8 cm-1 atau 4 cm-1

Pengukuran spektrum Jumlah Scan Use multiplex (Fellget) advantage to improve SNR (signal to noise ratio) of spectra. Take at least 16 spectra for a sample to improve SNR by a factor of 4. If you take 64 spectra at a spectral resolution of 8 cm-1, you can improve SNR by a factor of 8, and the total spectral collection time is about 1 minute.

Pengukuran spektrum Parameter yang dipertimbangkan dalam pembuatan spektrum FTIR: Fungsi Apodisasi : Happ-Genzel Resolusi : 4 cm-1 atau 8 cm-1 3. Jumlah scan : Paling tidak 32 Hal lainnya: - Pengukuran background dilakukan sebelum pembuatan spektrum sampel. Jika dimungkinkan secara fisik menyingkirkan gangguan yang disebabkan oleh uap air atau CO2 (misal dengan mem’purging’ menggunakan gas nitrogen, untuk CO2 dapat dieleminasi melalui setting alat atau pasca pengukuran) Jenis file untuk data: JCAMP-DX, .dpt, .CSV

Data preprocessing Preprocessing Jenis: Tujuan: To improve the robustness and accuracy of subsequent multivariate analyses To increase the interpretability of the data by correcting issues associated with spectral data acquisition Jenis: De-noising: boxcar, Savitsky Golay Spectral correction: Baseline, Derivatisation Normalization: Vector, SNV

Data preprocessing Preprocessing Visual effect of different pre-processing steps on a set of FTIR spectra

Data preprocessing Representative second derivative FTIR spectra of C. longa (A), C. xanthorrhiza (B), and Z. cassumunar (C)

Data preprocessing Spektrum original Prapemrosesan: linear baseline correction dan area normalization

Data preprocessing Spektrum original Prapemrosesan: standard normal variate

Data preprocessing Linear baseline correction and area normalization from \ to CL CX ZC Total % correct 7 28 35 0.00% 9 2 25 36 5.56% 1 22 30 73.33% 16 10 75 101 23.76% Linear baseline correction and maximum normalization from \ to CL CX ZC Total % correct 32 3 35 91.43% 1 36 97.22% 29 30 96.67% 33 39 101 95.05% Standard normal variate from \ to CL CX ZC Total % correct 33 2 35 94.29% 36 100.00% 30 37 29 101 98.02%

UV-Vis Spectroscopy and Chemometrics for Distinguishing of Four Curcuma Species from Indonesia M Rafi, R Jannah, R Heryanto, A Kautsar, DA Septaningsih. accepted in International Food Research Journal (2017)

Identifikasi dan Diskriminasi Curcuma species Kunyit (C. longa) Temu lawak (C. xanthorrhiza) Temu mangga (C. mangga) Temu Hitam (C. aeruginosa) Identifikasi dan Diskriminasi

Representatif spektrum UV-Vis empat spesies Curcuma UV-Vis spectra of Curcuma species Representatif spektrum UV-Vis empat spesies Curcuma

Diskriminasi 4 spesies Curcuma Instrumentasi: Spektroskopi UV-Vis Variablel: absorbans (210-500 nm) Pemrosesan sinyal: standar normal variate Metode kemometrik: canonical variate analysis (CVA), cross validation 95%

Fourier transform infrared spectroscopy combined with chemometrics for discrimination of Curcuma longa, Curcuma xanthorrhiza and Zingiber cassumunar E Rohaeti, M Rafi, UD Syafitri, R Heryanto, Spectrochimica Acta Part A 137 (2015) 1244

Temu lawak (C. xanthorrhiza) Diskriminasi spesies Kunyit (C. longa) Temu lawak (C. xanthorrhiza) Bangle (Z. cassumunar) Serbuk……??

Pengambilan dan Preparasi Sampel Lokasi pengambilan sampel ditunjukkan dengan tanda panah Gambar diunduh dari www.compsoc.bandungfe.net

Pembuatan Spektrum FTIR serbuk Ekstrak etanol Detail spektrum FTIR ekstrak etanol lebih baik dibandingkan dengan serbuk

Pembuatan Spektrum FTIR Pengoptimuman Pembuatan Spektrum IR a b c Spektrum IR ekstrak etanol kunyit (a) resolusi 4 cm-1, kecepatan pemayaran dan latar 32 (b) resolusi 8 cm-1, kecepatan pemayaran dan latar 32, (c) resolusi 16 cm-1, kecepatan pemayaran dan latar 32.

Pembuatan Spektrum FTIR Representative FTIR spectra of C. longa (A), C. xanthorrhiza (B), and Z. cassumunar (C)

Diskriminasi spesies Instrumentasi: Spektroskopi FTIR Variabel: 2000-400 cm-1 Prapemrosesan sinyal: standard normal variate Metode kemometrika: canonical variate analysis (CVA) CL ZC CX Plot CVA

Demo

Terima Kasih ! Klaster Riset Metabolomik - DRI Institut Pertanian Bogor