DEDE KURNIAWAN NIM:1348201017 FARMASI A

ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA SECARA HAYATI Potensi Antibiotika : Adalah kekuatan suatu antibiotika dalam menghambat atau membunuh pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg atau ug/mg Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi merupakan metode penetapan hayati, sebagai jasad renik digunakan mikroorganisme. Sebagai pembanding digunakan antibiotika yang telah diketahui kemurnian dan kekuatan/potensinya.

ANALISIS POTENSI ANTIBIOTIKA SECARA HAYATI Prinsipnya: Adalah membandingkan respon dari mikroba uji yang peka dalam kondisi percobaan yang sama terhadap zat baku standar dan zat uji. Sebagai zat baku standar digunakan zat/senyawa yang telah diketahui kemurnian dan kekuatan/potensinya.

Respon yang diamati : Adalah berupa efek hambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji yang ditunjukkan oleh daerah bening ( inhibition zone ) di sekeliling zat uji (Cara Difusi) atau kekeruhan ( turbiditas ) yang ditimbulkan oleh pertumbuhan mikroba dalam medium cair (Cara Turbidimetri).

Cara Analisis : Analisis potensi antibiotika yang dilakukan selama ini dapat dikelompokkan atas 2 bagian yaitu 1 . Cara Difusi Agar (Cara Lempeng) Prinsipnya, yaitu zat yang akan diuji berdifusi dari pencadang (reservoir )ke dalam medium agar yang telah diinokulasi dengan mikroba uji.Inkubasi selama waktu tertentu dan kemudian diamati adanya hambatan pertumbuhan mikroba uji dan diukur diameter hambatannya.Diameter hambatan yang terbentuk dibandingkan dengan diameter baku standar

2.Cara Turbidimetri (Cara Tabung) Dengan cara ini digunakan media cair, hambatan pertumbuhan mikroba uji diukur dengan menentukan kekeruhan (turbiditas) larutan dengan suatu alat yang cocok, misalnya spektrofotometer.

Beberapa faktor penting yang diperlukan dalam analisis potensi antibiotika: 1. Mikroba Uji - Mikroba uji yang digunakan harus berasal dari galur murni - Dapat memberikan respon yang bertingkat antara peningkatan konsentrasi dengan peningkatan daerah hambatannya. - Untuk penetapan dengan cara difusi, daerah hambatan yang terbentuk harus jelas dan mudah diukur, - Untuk penetapan cara tabung (turbidimetri) perbedaan kekeruhan pada tingkat dosis tertentu harus terlihat jelas.

2. Baku Pembanding Biologi Sebagai baku pembanding biologi (biological reference) digunakan antibiotika yang telah diketahui kemurniaan dan potensinya secara pasti. Baku pembanding ini direkomendasi oleh Badan Kesehatan Dunia (WHO) dan di Indonesia melalui Badan POM RI (SBI, SPI, SBN, SPN, SBL) Baku ini diberikan dalam bentuk baku sekunder atas permintaan laboratorium-laboratorium penelitian atau Perguruan Tinggi.

3. Media Perbenihan Media perbenihan yang digunakan harus mendukung pertumbuhan mikroba uji atau dapat menumbuhkan mikroba uji dengan baik. Media perbenihan tidak boleh mengandung zat yang bersifat antagonis ataupun mempengaruhi aktivitas antimikroba dari antibiotika yang diperiksa. Di pasaran banyak ditemui media perbenihan dengan berbagai merek dengan kode Antibiotic Medium No. 1, 2,3 dan sebagainya.

4. Larutan Dapar Digunakan untuk melarutkan antibiotika yang akan diperiksa,baik baku pembanding maupun sampel uji.Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan dengan sifat dan stabilitas bahan yang akan diuji.

Kelebihan dan kekurangan dari kedua metode 1. Cara turbidimetri , biasanya mempunyai range daerah pengerjaan yang sempit dengan perbandingan tingkat dosis kurang dari 5 : 1. Sebaliknya pada cara difusi, range tersebut lebih lebar sehingga dimungkinkan perbandingan tingkat dosis sampai 100 : 1. 2. Cara turbidimetri, hanya memerlukan waktu inkubasi kurang dari 4 jam, sedangkan cara difusi memerlukan waktu paling kurang 18-24 jam.

3. Cara turbidimetri adalah mengukur aktivitas total dari antibiotika yang diuji, sedangkan cara difusi tergantung pada kecepatan difusi zat aktif, sehingga ada kemungkinan tidak mengukur aktivitas totalnya. 4. Cara turbidimetri tidak dipengaruhi oleh sifat difusibilitas dari zat aktif, sedangkan cara difusi sangat dipengaruhi oleh hal lain tersebut.

Faktor yang dapat mempengaruhi luas daerah hambatan dengan cara difusi agar : Ingredien Medium Pertumbuhan 2. Pemilihan Medium Pertumbuhan 3. Pengaruh pH 4. Ukuran Inokulum 5. Stabilitas Mikroorganisme 6. Aktivitas Antibiotika 7. Waktu Inkubasi

Prosedur Metode Analisis potensi Secara Turbidimetri : Disiapkan beberapa tabung, sesuai dengan didisain percobaan yang telah dirancang.Diisi dengan larutan uji dan larutan pembanding dengan susunan dosis tertentu dan kemudian ditambahkan medium cair yang telah diinokulasi dengan mikroba uji. Selanjutnya tabung diinkubasi pada suhu 37 C dan diaduk pada suatu shaker inkubator selama 3- 4 jam. Setelah inkubasi, pertumbuhan mikroba uji dihentikan segera dengan jalan merendamkan tabung- tabung tersebut ke dalam penangas air suhu 80 C atau dengan penambahan larutan formaldehid ke dalam masing- - masing tabung.

Suhu penangas air tidak boleh melebihi 80 C, karena akan menyebabkan koagulasi protein. Selanjutnya kekeruhan yang disebabkan oleh pertumbuhan mikroba uji diukur menggunakan spektrofotometer uv- vis pada panjang gelombang 530 nm. Perhitungan potensi sama dengan cara difusi, dalam hal ini data kekeruhan menggantikan data diameter hambatan.

Sebanyak 36 tabung ditaruh dalam rak tabung, hingga pada setiap deret dan kolom terdapat 6 tabung. Tabung diisi secara acak dengan larutan pembanding dan sediaan uji sejumlah 0,1 ml dengan susunan dosis 3 : 3 sedemikian rupa sehingga tiap dosis terdapat dalam setiap deret dan kolom. Ditambahkan pada setiap tabung masing- masing 0,9 ml inokulum. Siapkan dua tabung blanko, pada satu tabung tuangkan 10 ml inokulum dan pada tabung yang lainnya tuangkan 10 ml inokulum dan 0,5 ml larutan formaldehid P.

Inkubasi dalam tangas iar suhu 37±0,5 C selama 3-4 jam Inkubasi dalam tangas iar suhu 37±0,5 C selama 3-4 jam. Setelah inkubasi pada masing-masing tabung, kecuali tabung blanko, tambahkan masing-masing 0,5 ml larutan formaldehid P. Selanjutnya dengan menggunakan spektrofotometer, ukur transmittan pada panjang gelombang 530 nm terhadap blanko tabung yang berisi inokulum dan larutan formaldehid P. Hitung potensi dengan cara Biometri.

Faktor yang harus diperhatikan pada penentuan potensi antibiotika dengan cara turbidimetri: 1. Gunakan tabung- tabung dengan ukuran dan ketebalan yang seragam sehingga rambatan panas yang diterimanya juga sama. 2. Medium perbenihan yang telah diinokulasi hendaknya didinginkan sebelum dimasukkan ke dalam tabung. 3. Gunakan bejana inkubasi/shaker incubator dg kapasitas yang memadai, sehingga tabung- - tabung dapat diaduk dengan kapasitas yang sama

4. Pertumbuhan mikroba uji diakhiri pada waktu yang sama 4. Pertumbuhan mikroba uji diakhiri pada waktu yang sama. Bila menggunakan panas, pakailah penangas air yang besar dengan suhu 80Csehingga rak tabung dapat dicelupkan secara sempurna pada waktu yang sama.Bila menggunakan formalin, sebelum pemberian formalin rak tabung diangkat dari bejana inkubasi, lalu dicelupkan ke dalam air es, baru kemudian diberikan formalin.

Kurva Dosis-Respon pada penentuan potensi antibiotika dengan cara turbidimetri:Kurva antara dosis dan respon yang diberikan umumnya linier pada range dosis tertentu.Dosis kerja harus dipilih pada daerah linear ini. .Sebelum analisis harus ditentukan kurva ini dulu untuk pemilihan dosis yang tepat.Kurva diplot konsentrasi sel = transmittan sebagai sumbu y dan log dosis pada sumbu x x