ISOLASI/EKSTRAKSI DNA(1x) PEMOTONGAN DAN PENYAMBUNGAN DNA (1x) DNA Rekombinan (1x) Dr. Ir. Atra Romeida, M.Si.

ISOLASI DNA Merusak/membuka sel /lysyis dinding sel (phisik atau kimia) Memisahkan lipid (membran sel) dengan penambahan detergent (Buffer) Mengeliminasi proteins dengan penambahan enzim protease Precipitasi DNA dengan alcohol — biasanya ethanol or isopropanol yang didinginkan. Karena DNA tidak larut di dalam alcohols, maka akan mengumpul atau menjadi pelet bila disentrifugasi. Pemurnian dengan mengulang metode yang sama. Larutkan dengan air atau buffer. Jumlah DNA yang diekstrak : mg/ml atau ug/ml

DNA Isolasi/ekstraksi DNA dari Jaringan/sel ( organel apa ?) Eliminasi RNA dengan enzyme RNA-se Kuantifikasi dengan spektrophotometer pada absobent 260 nm. DNA disimpan dan dapat digunakan sewaktu-waktu, disebut dengan template DNA Penyimpanan: 4oC, -20oC, atau -80oC (tergantung tujuan)

Metode Ekstraksi DNA Metode CTAB Metode SDS Metode DNAZole Metode KIT SIGMA Metode Modifikasi

Satuan pengukuran: Kg gram mgram ugram nanogram (ng) L ml ul Berdasarkan standar kurva, bila pembacaan alat = 1, maka jumlah DNA adalah 50 g/ml. Harus memahami faktor pengenceran, yang dimasukkan dalam kuvet adalah 100 l. Berapa berat DNA dalam kuvet tersebut ? Pembacaan alat X 50 ug/ ml X vol dalam kuvet = 1 X 50 ug/ ml X 0.1 ml = 5 ug Pembacaan alat adalah 0.5 dan total volume yang diperoleh adalah 2 ml. Berapa berat DNA? 0.5 setara dengan 25 ug/ml X 2 ml = 50 ug

CONTOH QUANTIFIKASI DNA Berdasarkan pengukuran spektrophotometer: bila pembacaan alat pada spektrum 260 nm = 1, maka jumlah DNA pada larutan adalah 50 g/ml. Untuk mengetahui jumlah DNA, hasil ekstraksi diencerkan dari 1 l menjadi 100 l, dan kemudian discan kedalam alat. Hasil pengukuran menunjukkan 0.025. Bila total volume ekstraksi adalah 40 l, berapa g total DNA yang diekstraksi.

1. Diketahui: Total Volume ekstraksi = 40 l Pembacaan Alat = 0.025 Jumlah DNA = 0.025/1 x 50 g/ml x 40 l = ………….. g

Penghitungan konsentrasi DNA Alat: Spektrophotometer Dasar penghitungan adalah nilai A 260 nm (nilai absorbsi). dsDNA dengan konsentrasi 1 mg/ml mempunyai A260 sebesar 20 ssDNA atau RNA mempunyai A260 lebih kurang sebesar 25. Tingkat kemurnian asam nukleat dapat diestimasi melalui penentuan nisbah A260 terhadap A280 (absorpsi protein). Molekul dsDNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sebesar 1,8. Molekul ssRNA murni mempunyai nisbah A260 /A280 sekitar 2,0. Oleh karena itu, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 lebih dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh RNA. Sebaliknya, suatu sampel DNA yang memperlihatkan nilai A260 /A280 kurang dari 1,8 dikatakan terkontaminasi oleh protein.

Kuantifikasi DNA menggunakan spektrofotometer dengan membaca absorban pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Pembacaan A260 =1 berarti konsentrasi DNA yang didapat sebesar 50 g/ml. Konsentrasi DNA yang didapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: DNA (g/ml) = A260 x faktor pengenceran x 50 Kemurnian DNA ditetapkan berdasarkan nilai rasio A260/A280. Batas kemurnian yang biasa dipakai dalam analisis molekuler mempunyai rasio A260/A280 sekitar 1.8-2.0 (Sambrook et al., 1989).

Terima Kasih