PCR based techniques

STRUKTUR DNA

PCR Thermocycler = mesin PCR = Mesin DNA PCR (polymerase chain reaction): teknik untuk mengamplifikasi (melipat gandakan) DNA secara invitro. PCR sangat spesifik, hanya fragmen DNA yang diinginkan yang diamplifikasi, dan sangat sensitif, tidak lagi memerlukan jumlah DNA dengan ukuran mikrogram, tetapi secara teori meskipun dari singel sel saja akan dapat diamplifikasi dengan PCR.

Kegunaan PCR Untuk skrining atau sekuensing secara cepat Sebagai pelacak peristiwa kriminal pada bagian forensik Diagnosa secara dini penyakit hepatitis B, TBC dll Mendeteksi bakteri patogen dalam air dan lingkungan (sensitivitas 1-10sel/100ml air).

Protokol reaksi PCR Siapkan campuran reaksi yang terdiri dari: 200ng DNA template, 0.15M dari masing-masing oligonukleotida primer, 200M dari masing-masing dNTPs, 2mM MgCl2, 10x buffer dan 1,5 unit Taq DNA polymerase  dalam 0,6ml tabung effendorf dengan total volume 50L Kontrol negatif (tanpa DNA template) selalu disertakan dalam semua reaksi melakukan 25-35 siklus PCR

Siklus PCR Denaturasi : 94oC, 15 detik Primer annealing : 55oC, 30 detik Primer extension: 72oC, 1.5 menit Akhiri siklus terakhir dengan perpanjangan pada 72oC selama 5 menit. Kemudian hentikan dengan mendinginkan pada suhu 4oC dan menambahkan 10mM EDTA (bila diperlukan).

Hal-hal penting yang perlu diperhatikan dalam reaksi PCR 1. Konsentrasi enzim Taq DNA polimerase, konsentrasi: 1-2.5 unit per 5L reaksi. Perlu optimisasi. Konsentrasi enzim terlalu tinggi  background non-spesifik, terlalu rendah  tidak cukup produk. 2. Konsentrasi dNTPs Konsentrasi masing-masing dNTPs: 200M  hasil yang baik. Pengurangan konsentrasi dNTPs dapat mengurangi mispriming pada tempat-tempat bukan target, dan mengurangi kemungkinan perluasan kesalahan penggabungan nukleotida.

3. Konsentrasi Magnesium Sangat penting untuk dioptimumkan konsentrasinya. Mg mempengaruhi: penguatan primer (primer annealing), suhu peruraian pada template, spesifikasi produk, formasi primer-dimer, dan aktifitas serta fidelitas enzim. Masing-masing reaksi PCR diperlukan 0.5-2.5mM melebihi konsentrasi dNTP. EDTA dalam stok primer dapat mengganggu konsentrasi optimum mg.

4. Primer Umumnya antara 0.1-0.5M (+12pM lebih baik). Terlalu tinggi konsentrasi primer: terjadi kesalahan priming (mispriming) dan penumpukan hasil yg tidak spesifik serta menyebabkan munculnya primer-dimer (independent template),  produk yg diinginkan menjadi rendah. Usahakan G-C content sekitar 50-60%, melting temperatur antara 55-80oC. Primer annealing: tergantung pada komposisi dasar, panjang dan konsentrasi primer, normalnya 5oC dibawah melting temperaturnya (hasil terbaik biasanya antara 55-75oC). Peningkatan suhu annealing dapat menyedikirtkan kesalahan pemanjangan nukleotoda. Primer extension, tergantung pd panjang dan konsentrasi target sekuen serta temperatur; optimumnya 72oC.

6. Waktu dan suhu denaturasi 5. DNA template 200ng DNA template, terlalu tinggi  non-spesifik produk. 6. Waktu dan suhu denaturasi Denaturasi DNA template yg tidak komplit kegagalan PCR. Umumnya 94oC selama 30detik atau 97oC selama 15 detik cukup bagus. GC content tinggi, perlu suhu denaturasi sedikit lebih tinggi. 7. Jumlah siklus tergantung konsentrasi permulaan DNA target bila parameter yg lain baik. Terlalu banyak siklus  non-spesifik background; terlalu sedikit  produk sedikit. Antara 25-35 umumnya memberikan hasil yg baik.

Hasil Reaksi PCR setelah elektroforesis Figure 1. Photograph of an ethidium bromide stained agarose gel showing the specificity of the PCR products (223 bp) of locus 1 spanning intron IV and Exon V of the growth hormone gene, amplified using primers GH1 and GH2. Lane 1: Madura 1 (M1), 2: (M2), 3: Bali 1 (B1), 4: (B2), 5: Ongole derived1 (PO 1), 6: PO 2. 100bp marker 1 2 3 4 5 6 223bp 100bp 600bp

Hasil PCR-RFLP setelah dilakukan elektroforesis 100bp marker 1 2 3 4 5 6 223bp 100bp 600bp Figure 1. Photograph of an ethidium bromide stained agarose gel showing the specificity of the PCR products (223 bp) of locus 1 spanning intron IV and Exon V of the growth hormone gene, amplified using primers GH1 and GH2. Lane 1: Madura 1 (M1), 2: (M2), 3: Bali 1 (B1), 4: (B2), 5: Ongole derived1 (PO 1), 6: PO 2.

100bp marker 1 2 3 4 223bp 100bp 600bp 171bp 52bp Figure 2. Gel photographs showing growth hormone gene polymorphisms detected by PCR-RFLP using AluI in locus 1 fragment. Lane1 = LV, Lane 2 = VV, Lane 3 = LL, and lane 4 = Uncut.