PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI LAKASE Trichoderma LBKURCC1 ISOLAT TANAH RIAU PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGERTAHUAN ALAM UNIVERSITAS RIAU PEKANBARU Dra. Andi Dahliaty, MS (NIDN ) Dra. Silvera Devi, M.Si (NIDN ) Sri Herlianty, S.T, M.T (NIDN )

1995 : Screening mikroorganisme penghasil enzim (Trichoderma TNJ56) Isolasi dan penentuan aktivitas dan aktivitaas spesifik dari laccase pada crude enzim Isolasi selulase, kitinase, xylanase, pada crude enzim. Penentuan aktivitas dan aktivitas spesifik enzim. Uji genotip mikroorganisme penghasil enzim (Trichoderma asperellum LBKURCC1) pemurnian dan karakterisasi enzim laccase dari T. Asperellum LBKURCC1, penentuan aktivitas dan aktivitas spesifik enzim dari setiap tingkatan kemurnian enzim laccase : Isolasi dan karakterisasi. Penentuan berat molekul, uji kinetika enzim, pI, pH, temeperatur optimum, dan penentuan urutan asam amino dari laccase 2021 : Rancangan gen penghasil lacccase 2022: Ekspresi gen laccase dalam suatu mikroorganisme tertentu ROADMAP PENELITIAN

1.Microcentrifuge 2. shaker 3.spektrofometer UV/Vis 4.HPLC 5.Sonicator 6.Lampu UV 7.Sentrifuga berpendingin 8.water bath thermostat ; S 9. haking Incubator 10.timbangan analitis 11.Vortex Mixer 12. Autoclave All American Electric model No. 25X 1.Agarosa 2.buffer natrium asetat 0,2 M (pH 5), 3.ABTS, 4.bovin serum albumin, 5.ekstrak yeast, 6.Galllic Acid, 7.NaN 3, 8.KH 2 PO 4, 9.Guaiacol, 10.isopropanol, 11.corning steril syringe filter 0,4 μm, 12.Ammonium Sulfat, 13.ultrafiltrasi vektaspin 3 whattman, 14.dialysis kit, 15.sephadex LH-20, d 16.isposible in-line gas/ liquid filters for fermentor, ALAT BAHAN METODOLOGI

Peremajaan Fungi Trichoderma asperellum LBKURCC1 Isolat diambil menggunakan ose steril digoreskan pada agar miring secara zig-zag diinkubasi selama 3 hari pada suhu 25˚C disimpan pada suhu -4˚C PROSEDUR PENELITIAN

Produksi dan Pemurnian Lakase Media dengan sumber karbon yang terbatas pada 27 ± 2°C, agitasi (125 rpm/menit), 6 hari, 0,1 mol buffer sodium asetat pH 4,5 Saring dg kertas wathman.Supernatan/ Crude Enzyme Saring dg kertas wathman.Supernatan/ Crude Enzyme 6000 rpm selama 10 menit + aseton 66%, didiamkan pada -20°C selama 6 jam, setrifuge 5600xg selama 10 menit Pelet enzim diresuspensi dengan buffer sodium asetat dan didialisis untuk menghilangkan garam Dikolom kromatografi sephadex G-100 dan dielusi dengan 0,1 NaCl dalam buffer. Fraksi yang menunjukkan aktivitas laccase dikumpul kemudian dipekatkan dengan freeze-drying, simpan pada 4°C Pellet Laccase dilarutkan dalam buffer asetat, dimasukkan ke kolom DAE-sepharose (anion exchange kolom kromatografi), dielusi dg larutan NaCl gradien konsentrasi 0-0,5 M, setiap eluen diukur pada λ 280 sampai diperoleh abs=0,02 Aktivitas laccase diukur dengan substrat ABTS pada 436 nm. 1 unit aktivitas laccase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengoksidasi 1 μM ABTS/menit. PROSEDUR PENELITIAN

dilakukan dengan uji elektroforesis 2 dimensi dan/atau membuat satu seri larutan pH kemudian enzim dilarutkan kedalam masing-masing larutan pH tersebut. pI ditentukan dengan melihat endapan terbanyak pada pH tersebut. Kemudian dilakukan uji aktifitas. Untuk mengevaluasi pengaruh pH terhadap aktivitas lakase. Subtrat dilarutkan pada berbagai konsentrasi pH 3.0 sampai 7.0. Ditambah enzim pada 1 konsentrasi diinkubasi pada t tertentu, temperatur 30°C, kemudian ukur aktivitas nya (dg mengukur Abs pd λ= spektrofotometer Pengaruh temperatur terhadap produksi lakase dilakukan melalui inkubasi pada temperatur 25, 30, 35, 40, 45, dan 50°C. difermentasi selama 7 hari di media dengan pH awal 4,5. Kemudian sampel disentrifus dan supernatan digunakan untuk menentukan aktivitas lakase. 1. Penentuan pI 2. Penentuan pH optimum Penentuan temperatur optimum PROSEDUR PENELITIAN

Penentuan KM dilakukan dengan 3 jenis substrat dengan 5 varisai konsentrasi. Kemudian diukur aktifitasnya (kecepatan reaksi). Dengan membuat kurva M-M, maka KM dapat ditentukan. Untuk lebih jelasnya kita buat kurva LB. Kesimpulan dapat diambil jika lakase dikatan baik apabila KM relatif kecil. Kandungan protein sampel diketahui dengan menggunakan metode Bradford atau Lowry; dimana bovin serum albumin (BSA) sebagai standar. Uji protein ini digunakan untuk mengetahui aktivitas spesifik lakase. 4. Uji protein 3. Penentuan konstanta Michaelis- menten (Km) PROSEDUR PENELITIAN

LUARAN YANG DIRENCANAKAN Kristal lakase dan karakterisasinya Karakterisasi lakase dari Trichoderma asperelum LBKURCC1 yaitu pI, pH, temperatur optimum, inhibitor dan aktivator. penentuan berat molekul, dan uji Km, Vm da MW serta Jumlah Rantai PP

1. BIAYA PENELITIAN BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN

2. JADWAL PENELITIAN BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN