TEKNIK DAN PROSEDUR PENELITIAN OLEH Prof. Dr. Ir. Chanif Mahdi, MS.

TAHAPAN PELAKSANAAN PENELITIAN (CANE,1999) Literatur Provide Experiment Special Interest General Interest Literatur Hiptesis Experiment Question Design Experiment Experiment Data collection Data Analysis Result /Conclusion Reporting Popular paper Scientific Paper

Research Requirements Characters of living unit Parameters Variables Data Equipments Technology Concepts Theories

Kedalaman kajian biomedical research

S2 : Pengembangan dan Penerapan Ilmu Disertasi/Tesis Merupakan Karya Tulis Ilmiah Berdasarkan Hasil PeneIitian Bobot Penelitian : S1 : Penerapan Ilmu S2 : Pengembangan dan Penerapan Ilmu S3 : Pengembangan- Penciptaan Ilmu Baru

TAHAPAN DALAM PENGUASAAN TEORI DAN OPERASIONAL PENELITIAN 1. Penguasaan Membuat Kerangka Teori dari Study Pustaka. 2. Mampu Membuat / Menurunkan Kerangka Konsep Dari Kerangka Teori 3. Mampu Membuat/ Menyusun Kerangka Operasional Berdasarkan Penguasaan Metode Laboratorium dan Instrumentasi.

PENDAHULUAN Profil dan karakter Protein Apoptosis Nekrosis iNOS Gene iNOS Protein SOD, GSH Formaldehid Sistim enzimatis terganggu Produksi ROS Degradasi IKB-NF-kB IKB-NFKB inaktif Proses Respirasi Sitokrom iNOS Ekspresi Gen Keradangan Stress Oksidatif Peroksidasi Lemak Kerusakan Sel Hepar NFKB Aktif Penambahan Yoghurt O2* + NO* ONOO¯ MDA Profil dan karakter Protein .OH- Apoptosis Nekrosis PENDAHULUAN

KERANGKA KONSEPTUAL FORMALDEHID HEPAR YOGURT 1. AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ( SOD, GSH). 2. KERUSAKAN OK- SIDATIF ( MDA, i NOS, APOPTOSIS) 3. PROFIL DAN KA- RAKTER PROTEIN HEPAR YOGURT HEPAR ADALAH ORGAN TUBUH YANG SANGAT SENSITIF TERHADAP SENYAWA TOKSIK. SA- LAH SATU FUNGSI HEPAR, ADALAH BERPERAN DALAM DETOKSIKASI SENYAWA TOKSIK YANG MASUK DALAM TUBUH. KEBERADAAN FORMALDEHID DAN YOGURT DALAM TUBUH BERPENGARUH TERHADAP AKTIVITAS ANTIOKSIDAN ENZIMATIS, KERUSAKAN OKSIDATIF, PROFIL DAN KARAKTER JARINGAN PROTEIN HEPAR.

METODE PENELITIAN PENELITIHAN TAHAP -2 PENELITIAN TAHAP - 3 EFEK PAPARAN FORMALDEHID DALAM MAKANAN DAN SUPLEMENTASI YOGURT TERHADAP AKTIVITAS ANTIOKSIDAN, KERUSAKAN OKSIDATIF, PROFIL PROTEIN JARINGAN HEPAR TIKUS (Rattus norvegicus) PENELITIAN TAHAP - 3 PROFIL DAN KARAKER PROTEIN SPESIFIK 29,6 kDa ( PSForm 29,6 kDa) HASIL ISOLASI DARI HEPAR TIKUS ( Rattus norvegicus) YANG DIPAPAR FORMALDEHID DALAM MAKANAN PENELITIAN TAHAP -1 EFEK PAPARAN FORMALDEHID DALAM MAKANAN TERHADAP AKTIVITAS ANTIOKSIDAN , KERUSAKAN OKSIDATIF, JARINGAN HEPAR TIKUS (Rattus norvegicus) TAHAPAN PENELITIAN

VARIABEL YANG DIUKUR 1. AKTIVITAS SUPEROKSID DISMUTASE (SOD ) Prinsip: mengukur formasan hasil reduksi NBT (Supernatan j homoginat hepar + Xantin oksidase  .O-2 O-2 + H2 SOD  H2O2 selanjutnya H2O2 + NBT NitroBlue Tetrazolium tereduksi timbul warna biru ( 580 nm) 2. GLUTATHION TEREDUKSI ( GSH ) Prinsip : GSH dioksidasi oleh DTNB menjadi GSSG dan TNB ( warna kuning ), diukur pada  415 nm ( Supernatan + DTNB ( Dithionitro Benzoic acid)  TNB (  415) 3. PRODUKSI MDA JARINGAN HEPAR ( Prinsip : MDA mrpk produk sekunder dari lipid peroksidasi akan bereaksi dengan thio- barbituric acid ( TBA) pada suasana asam dan suhu 97-1000C memberikan warna pink diukur pada  532 nm 4. EKSPRESI iNOS ( Immunohistokimia) Prinsip : Slide hepar diaplikasikan dengan beberapa reaktan dan dicuci buffer PBS 7,4) Dinkubasi dengan antibodi primer anti Rat iNOS ( semalam), dicuci dengan PBS 7,4. Ditetesi dengan antibodi sekunder berlabel biotin ( Anti Rabbit IgG biotin labelled ), diinkubasi 1 jam, dicuci dengan PBS 7,4 , ditetesi dengan dengan SA-HRP , dicuci dengan PBS 7,4, diaplikasikan dengan chromogen (DAP= Diamino Benzidin), dicuci dengan dengan akuades, dengan PBS 7,4, dilakukan counter staining dengan Mayer hematoxylen, dicuci dengan air. Langkah terakhir , preparat dikeringkan dan dimounting dengan entelan, serta ditutup dengan cover glass.

Lanjutan variabel yang diamati 5. Histopatologi hepar ( apoptosis) Prinsip: Slide dicuci dengan menggunakan PBS pH 7,4 diinkubasi dengan menggunakn 20 µg/mL proteinase selama 15 menit suhu 370C. Dicuci dengan PBS pH 7,4 masing- masing 5 menit. Inkubasi dengan 3% H2O2 selama 15 menit,cuci dengan PBS pH 7,4 Inkubasi dengan menggunakan Tunel Fragmented DNA Labelling suhu 370C, selama 60 menit. Cuci denganPBS pH 7,4 selama 5 menit. Inkubasi dengan larutan H2O2 selama 4 menit pada suhu 370C. Cuci dengan PBS pH 7,4 selama 5 menit. Tetesi dengan substrat untuk peroksidase (DAD-Diamino benzidin) pada suhu ruang selama 20 menit, cuci dengan PBS pH 7,4. Counter staining menggunakan Mayer hematoxilen, yang diinkubasi selama 10 menit. Cuci dengan air kran, bilas dengan akuades, dan kering anginkan. Mounting dengan menggunakan entelan, dan tutup dengan coverglass. Amati dengan mikroskop. 6. Profil dan Karakter Protein Profil protein ditentukan dengan metode SDS- PAGE. Karakter protein dengan metode ELISA, dilanjutkan dengan Dot Blot dan Western Blot.

KERANGKA OPERASIONAL PENELITIAN TAHAP -2 Tikus Wistra jantan BB 100 g umur 2 bulan Paparan formaldehid dan suplementasi yoghurt 2 ml/hari selama 7 hari dengan dosis ( 0, 25, 50, 75 dan 100 ppm dalam makanan selama 7 hari Bedah Dan dikoleksi organ hepar Organ Hepar MDA SOD iNOS GSH PA/Apop Profil Protein SDS PAGE Spectrofotometri IHK

Imunohistokimia Adalah bagian dari ilmu jaringan yang mempelajari perubahan kimia dan sel- sel imun yang terjadi pada tingkat sel dan jaringan . Tugas Mahasiswa S2 : Melakukan mereview Jurnal dan menseminarkan tentang berbagai metode penetapan : 1. Aktivitas antioksidan enzimatis dan koenzim pada sel dan jaringan akibat obat dan racun( SOD, GSH, Katalase, NAD/NADH Hubungannya dengan stres oksidatif ( Spektrofotometer).

Kerusakan Oksidative dan parameternya MDA, NO, NOS, Sitokin proinflamasi 3. Imuno dan histokimia Hubungannya dengan penetapan berbagai sitokin proinflamasi. Nekrosis dan apoptosis dan antibodi ( SDS PAGE, Dot Blot, Western Blot, ELISA, Mikroskop) dll