SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI (STIFARM) PADANG 2019 HASIL PENELITIAN

Penyangraian kopi Akrilamida C3H5NO toxic Kopi Bubuk  menyebabkan Kanker pada manusia dan  bersifat neurotoksik

RUMUSAN MASALAH 1. Apakah terdapat kandungan akrilamida dalam kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak yang dianalisis dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)? 2. Berapa kadar akrilamida dalam kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak yang dianalisis dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)? TUJUAN PENELITIAN 1. Untuk mengetahui adanya kandungan akrilamida dalam kopi bubuk tradisonal dan kopi bubuk luwak yang dianalisis dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). 2. Untuk menentukan berapa kadar akrilamida dalam kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak yang dianalisis dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT).

HIPOTESIS 1. Akrilamida terdapat dalam kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak yang dianalisis dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). 2. Didapatkan kadar akrilamida dalam kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak yang dianalisis dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). MANFAAT PENELITIAN 1. Penelitian ini diharapkan dapat menjadi sumber informasi mengenai cara analisis akrilamida dalam kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak serta menjadi bahan masukan bagi peneliti selanjutnya untuk pengujian akrilamida lebih lanjut. 2. Untuk memberikan informasi yang tepat kepada masyarakat mengenai adanya kandungan akrilamida dalam kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak dan berapa kadarnya masing- masing sampel kopi bubuk.

Akrilamida C 3 H 5 NO (sinonim: 2-propenamida, etilen karboksiamida, akrilikamida, asam propeonik amida, vinilamida) 1.Akrilamida merupakan senyawa kimia kristalin bening hingga putih tidak berwarna dengan bobot molekul 71,08 dan tidak berbau. 2.Senyawa ini sangat mudah larut dalam air, larut dalam aseton, etanol, metanol dan dimetil eter, namun, tidak larut dalam heksan, kloroform, dan diklorometana. 3.Akrilamida tidak bereaksi dengan asam, basa, agen pengoksidasi, logam dan garam. 4.Akrilamida adalah senyawa kimia alami yang terbentuk pada makanan yang kaya karbohidrat dalam proses pemanasan/pemanggangan/penggorengan pada suhu tinggi diatas (120 ºC). 5.Akrilamida adalah senyawa neurotoksik yang diklasifikasikan sebagai genotoksik dan karsinogen pada manusia. 6.Terbentuk melalui reaksi Maillard reaksi antara gula pereduksi (glukosa dan fruktosa) dengan gugus amino dari asam amino (asam amino yang bereaksi asparagin)

ALAT DAN BAHAN Alat dan Bahan Terlampir... Alat dan Bahan Terlampir...

PENGAMBILAN SAMPEL Sampel kopi bubuk diambil dengan cara simple random sampling (sampel random sederhana). Sampel yang dipilih adalah produk kopi bubuk robusta dengan bentuk sediaan yang berbeda yaitu tiga kopi bubuk tradisional dan tiga kopi bubuk luwak dengan cara mencatat merek kopi bubuk tradisional yang dijual disalah satu minimarket di daerah Gunung Pangilun kota Padang Sumatera Barat dengan batas kadarluarsa yang sama, kemudian diberi nomor lot, dikocok dan diambil tiga nomor lot untuk kopi bubuk tradisional. Untuk kopi bubuk luwak dengan cara yang sama yaitu mencatat merek kopi bubuk luwak yang dijual disalah satu minimarket yang sama di daerah Gunung Pangilun kota Padang Sumatera Barat dengan batas kadarluarsa yang sama, kemudian diberi nomor lot, dikocok dan diambil tiga nomor untuk kopi bubuk luwak (Jones, 2010).

Sampel yang digunakan adalah kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak yang dijual disalah satu minimarket di daerah Gunung Pangilun kota Padang Sumatera Barat dengan batas kadarluarsa yang sama. Maka diperoleh sampel kopi bubuk tradisional yang digunakan sebanyak 3 merek: Sampel (1): kopi bubuk gayo lion robusta bundo kanduang (CV. Sumatera Lion) 100 g, kadarluarsa Sampel (2): kopi bubuk asli robusta cap payung (CV. Minang saiyo) 100 g, kadarluarsa Sampel (3): kopi bubuk mandailing estate bundo kanduang (CV. Adipati Jaya Abadi) 100 g, kadarluarsa Sampel kopi bubuk luwak yang digunakan sebanyak 3 merek: Sampel (4): kopi bubuk luwak liar robusta (CV. Bernest Sriwijaya) 100 g, kadarluarsa Sampel (5): Kopi bubuk gayo lion coffee luwak (CV. Sumatera Lion) 100 g, kadarluarsa Sampel (6): kopi bubuk king of luwak (CV. Gajah Putih) 100 g, kadarluarsa

PROSEDUR PENELITIAN Pembuatan larutan induk akrilamida Pembuatan Larutan Uji Sampel Optimasi fase gerak Validasi metode KCKT Linearitas kurva baku Batas deteksi (BD) & batas kuantitasi (BK) Uji presisi Akurasi Analisa data Penetapan kadar Skema Kerja: Identifikasi akrilamida

Preparasi sampel 2,2 g bubuk kopi Masukkan ke dalam beaker gelas (+) 10 mL hexan untuk menghilangkan kandungan lemak dihomogenkan menggunakan orbital shaker dengan kecepatan 350 rpm selama 5 menit. dekantasi Residu keringkan dengan penguap vakum Residu kopi yang telah dihilangkan kandungan lemak Tahap penghilangan kandungan lemak dilakukan 2x Untuk mengekstraksi akrilamida dihomogenkan menggunakan orbital shaker dengan kecepatan 350 rpm selama 20 menit. (+) 20 mL aseton residunya ditambahkan dengan 4 mL fase gerak asetonitril dan aquabidest (15 : 85, v/v) Lapisan aseton disaring dengan menggunakan kertas saring dan kemudian diuapkan dengan waterbath Masing-masing larutan disaring dengan acrodisc syringe filter 0,45 µm kocok Sebanyak 20 µL diinjeksikan ke sistem KCKT

Optimasi Kondisi Analisis Siapkan larutan fasa gerak dengan berbagai perbandingan asetonitril dan aquabidest. Kemudian alirkan fasa gerak dengan konsentrasi standar akrilamida 10 µg/mL menggunakan pompa dan laju alir pada suhu 28 °C ke dalam kolom yang berisi fase diam shimadzu shimpack oktadesilsilika (ODS atau C 18 ) dengan volume penyuntikan 20 µL. Pemisahan akrilamida terjadi didalam kolom, hasil pemisahan dibaca oleh detektor Photodiode-Array (PDA) dengan panjang gelombang 200 nm dalam 12,5 menit. Selanjutnya dipilih kombinasi fase gerak dan laju alir yang memberikan pemisahan terbaik, berdasarkan puncak yang simetris, tinggi puncak, luas area dan waktu retensi yang sangat singkat dari larutan standar akrilamida (Prabowo et al., 2012).

Identifikasi Akrilamida Analisis kualitatif akrilamida dapat dilakukan dengan membandingkan waktu tambat yang sama (identik) dari kromatogram pada penyuntikan larutan sampel dengan kromatogram pada penyuntikan larutan baku pembanding akrilamida pada kondisi KCKT yang sama. Larutan standar akrilamida dan larutan uji hasil preparasi masing-masing disaring dengan membran filter 0,45 µm dan dimasukkan ke dalam vial KCKT. Sebanyak 20 µL diinjeksikan ke sistem KCKT dan ditentukan waktu retensi larutan standar dan larutan uji. Larutan uji dikatakan mengandung akrilamida jika waktu retensi larutan uji sama atau mendekati dengan waktu retensi larutan standar (Prabowo et al., 2012).

Pembuatan Standar dan Kurva Kalibrasi Akrilamida 0.01 g standar akrilamida ditimbang Larutan induk akrilamida dilarutkan dengan campuran fase gerak asetonitril : aquabidest (15 : 85, v/v) sampai tanda batas (konsentrasi 200 µg/mL). Larutan standar akrilamida dengan konsentrasi 10; 20; 30; 40 dan 50 ppm dibuat dengan mengencerkan larutan induk 200 µg/mL menggunakan fase gerak. Pipet larutan induk 200 µg/mL sebanyak 0,25 mL; 0.5 mL; 0.75 mL; 1 mL; dan 1.25 mL. Masing-masing larutan dimasukan ke dalam labu ukur 5 mL. Cukupkan dengan campuran fase gerak asetonitril : aquabidest (15 : 85, v/v) sampai tanda batas. Luas area di bawah kurva yang diperoleh dihitung dan buat kurva kalibrasi untuk menentukan persamaan garis regresi linier Y= a + bx (Prabowo et al., 2012). Masing-masing larutan saring dengan membran filter 0,45 µm. Larutan standar 10; 20; 30; 40 dan 50 ppm, masing-masing diinjeksikan sebanyak 20 μL ke dalam sistem KCKT. dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL Masing-masing larutan dimasukan ke dalam labu ukur 10 mL Dari data pengukuran kurva kalibrasi, kemudian dianalisis dengan persamaan garis regresi linear sehingga diperoleh koefisien korelasi (r) yang menunjukkan linearitasnya. Nilai linearitas (r) yang baik adalah < 0,999 (Prabowo et al., 2012). Uji Linearitas

Pengujian Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Batas deteksi dan batas kuantitasi ditentukan dari garis regresi linier dari kurva baku kalibrasi yang diperoleh. Nilai LOD = 3 × (SD/b) dan LOQ = 10 × (SD/b), standar deviasi (SD) respon ditentukan berdasarkan standar deviasi residual (simpangan baku residual) dari garis regresi yang dinyatakan sebagai Sy/x dan b merupakan nilai kemiringan (slope) pada persamaan garis atau regresi linier y = a + bx (Prabowo et al., 2012).

Uji Presisi (Keterulangan) Uji presisi dilakukan pada tingkat keterulangan (repeatability) dengan cara mengukur sebanyak 6 kali pada kosentrasi larutan baku akrilamida 30 µg/mL. Uji presisi (keseksamaan) ditentukan dengan parameter RSD (Relative Standar Deviasi). Nilai RSD yang diperbolehkan adalah ≤ 1 % (Prabowo et al., 2012).

Uji Akurasi (% Perolehan Kembali) Uji Akurasi (% Perolehan Kembali) Uji perolehan kembali dilakukan dengan metode simulasi (spiked) yaitu dengan cara menambahkan sejumlah larutan baku akrilamida ke dalam larutan uji sampel yang tidak mengandung akrilamida. Konsentrasi larutan baku akrilamida yang ditambahkan adalah 10 mg ke dalam 2,2 g kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak lalu diekstraksi dengan cara yang sama seperti pembuatan larutan sampel dilakukan masing-masing 3 kali pengulangan.. Kemudian dihitung nilai perolehan kembali baku pembanding yang ditambahkan pada larutan uji dinyatakan dengan % perolehan kembali. Nilai % perolehan kembali antara 85 % % (Prabowo et al., 2012).

Analisis Sampel dengan KCKT Masing-masing larutan sampel yang telah dipreparasi, dipipet 0.5 mL dan diencerkan dengan fase gerak ke dalam labu ukur 5 mL. Selanjutnya masing-masing larutan disaring menggunakan membran filter 0,45 µm dan dimasukkan ke dalam vial KCKT Sebanyak 20 µL diinjeksikan ke sistem KCKT. Selanjutnya diukur luas areanya dengan KCKT sesuai kondisi analisis optimum, dicatat luas areanya dan pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan. Kadar akrilamida dihitung dengan menggunakan persamaan regresi dari kurva kalibrasi (Prabowo et al., 2012).

Kromatogram optimasi fase gerak akrilamida pembanding 10 µg/mL dengan fase gerak campuran asetonitril : aquabidest (15 : 85, v/v) laju alir 0,5 mL/menit pada panjang gelombang 200 nm. Optimasi Fase Gerak

Identifikasi Akrilamida Data identifikasi akrilamida pembanding dan akrilamida sampel: Waktu retensi (tR) Standar akrilamida10 µg/mL 6,866 Sampel 16,855 Sampel 26,876 Sampel 36,865 Sampel 46,873 Sampel 56,837 Sampel 66,827 Keterangan: Sampel (1): kopi bubuk gayo lion robusta bundo kanduang Sampel (2): kopi bubuk asli robusta cap payung Sampel (3): kopi bubuk mandailing estate bundo kanduang Sampel (4): kopi bubuk luwak liar robusta Sampel (5): Kopi bubuk gayo lion coffee luwak Sampel (6): kopi bubuk king of luwak Hasil identifikasi akrilamida pada enam sampel kopi bubuk menunjukan keenam sampel kopi bubuk mengandung akrilamida. Semua sampel memberikan waktu retensi yang sama dengan baku akrilamida yaitu kisaran 6,8 menit. Hal ini menunjukan bahwa akrilamida dalam sampel terdapat satu puncak yang sama dengan akrilamida baku.

Kurva Kalibrasi Akrilamida Persamaan regresi linier yang diperoleh dari variasi konsentrasi (10, 20, 30, 40 dan 50 µg/mL ) larutan standar akrilamida adalah y = x dengan nilai koefisien korelasi yang didapatkan nilai r = 0,9993.

Nilai Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi dari akrilamida yang didapat adalah 1,99 µg/mL dan 6,63 µg/mL. NoXYYiy-yi(y-yi)² , x , x , x , x ∑ 1, x N5 SD ,0872 BD/LOD ( µg/mL ) 1, BK/LOQ ( µg/mL ) 6, Batas Deteksi dan Kuantifikasi

Presisi Uji presisi dilakukan pada tingkat keterulangan (repeatability) yaitu dengan cara melakukan pengukuran sebanyak 6 kali pada konsentrasi 30 µg/mL dari. Didapatkan nilai %RSD = 0,207% No Konsentrasi (µg/mL) Xi Xi -X ( Xi -X ) ∑ , SD19312,55 % RSD0,207

Akurasi Penambahan larutan standar akrilamida pada konsentrasi 10 mg kedalam sampel, didapat rata-rata % perolehan kembali kopi bubuk tradisional 99 % dan kopi bubuk luwak 104 % Kadar yang ditambahka n (mg) Luas Area Kadar akrilamida setelah penambahan standar (mg) % perolehan kembali akrilamida Rata-rata % perolehan kembali akrilamida % 10 mg % , % Data uji akurasi (% perolehan kembali) akrilamida dalam sampel kopi bubuk tradisional kiniko Kadar yang ditambahka n (mg) Luas Area Kadar akrilamida setelah penambahan standar (mg) % perolehan kembali akrilamida Rata-rata % perolehan kembali akrilamida , % 10 mg , %104 % , % Data uji akurasi (% perolehan kembali) akrilamida dalam sampel kopi bubuk luwak mandailing

Penetapan Kadar akrilamida pada kopi bubuk tradisonal dan kopi bubuk luwak Pada penelitian ini, diperoleh kadar akrilamida tertinggi terdapat pada sampel no.3 sebesar 1461 ± 63,89 µg/g, sedangkan kadar akrilamida terendah terdapat pada sampel no.5 sebesar 128 ± 3,24 µg/g. Sampel Waktu retensi Luas Area Kadar akrilamida (µg/mL) Kadar akrilamida (µg/g) kadar rata-rata akrilamida (µg/g) ± SD 1.6, , , , ± 12,17 6, , , , , , ± 7,58 6, , , , , , ± 63,89 6, , , , , , ± 3,54 6, , , , , , ± 3,24 6, , , , , , ± 1 6, , Keterangan: Sampel (1): kopi bubuk gayo lion robusta bundo kanduang Sampel (2): kopi bubuk asli robusta cap payung Sampel (3): kopi bubuk mandailing estate bundo kanduang Sampel (4): kopi bubuk luwak liar robusta Sampel (5): Kopi bubuk gayo lion coffee luwak Sampel (6): kopi bubuk king of luwak

Kesimpulan dan Saran  kesimpulan Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa: 1.Adanya kandungan akrilamida dalam kopi bubuk tradisional dan kopi bubuk luwak yang dianalisis dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). 2.Didapatkan kadar rata-rata akrilamida dalam sampel berturut-turut adalah 1115 ± 12,17 µg/g sampel (1); 687 ± 7,58 sampel (2); 1461 ± 63,89 µg/g sampel (3); 221 ± 3,54 µg/g sampel (4); 128 ± 3,24 sampel (5); 195 ± 1 µg/g sampel (6). Dari hasil yang didapat menunjukan semua sampel mengandung akrilamida dan nilainya melebihi ambang batas aman konsumsi akrilamida hingga 15 g dalam sehari.  Saran Dari penelitian ini semua sampel kopi bubuk yang diteliti mengandung akrilamida yang merupakan senyawa karsinogen dan berbahaya bagi manusia, karena itu perlu adanya penelitian lanjutan akrilamida terhadap sampel kopi bubuk dengan menggunakan metode ektraksi yang berbeda.

Pertanyaan: 1.Apa bahaya dari akrilamida? 2.Kenapa memilih KCKT? 3.Kenapa menggunakan KCKT fase terbalik? 4.Kendala saat penelitian? 5.Tujuan memvalidasi metode analisis? 6.Kenapa menggunakan kopi jenis robusta dalam penelitian ini?