 Kalus : kumpulan sel yang aktif membelah, tidak terorganisasi dan tidak terdiferensiasi  Tujuan : untuk memperoleh kalus dari eksplan yang diisolasi dan ditumbuhkan dalam lingkungan terkendali

 Umumnya kalus disusun oleh sel-sel parenkim yang mempunyai ikatan yang renggang.  Kalus dapat terbentuk secara alami karena : tanaman terluka, terserang serangga atau mikroba dan karena stress.  Dalam kultur in vitro, kalus dapat dihasilkan dari potongan organ yang steril, di dalam media yang mengandung zat pengatur tumbuh (ZPT) berupa auksin dan sitokinin dengan perbandingan yang relatif seimbang.

Faktor-faktor yang mempengaruhi kemampuan pembentukan kalus dari suatu eksplan : 1. Umur fisiologi jaringan waktu diisolasi 2. Musim pada saat bahan tanaman diisolasi 3. Bagian tanaman yang dipakai : organ yang berbeda akan berbeda kec. tumbuhnya. ex.embrio muda, hipokotil,kotiledon dan batang muda. 4. Jenis tanaman : dikotil berdaun lebar, monokotil, gymnospermae, pakis dan lumut.

 Pembentukan kalus, terjadi hanya sel di lapisan perifer (tepi) yang mengalami pembelahan secara terus- menerus. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor :  Ketersediaan oksigen  Keluarnya gas CO2  Kontak dengan nutrisi lebih besar  Cahaya  Penghambat yang bersifat folatik lebih cepat menguap

Dari eksplan batang, akar dan daun biasanya dihasilkan kalus yang heterogen dengan berbagai macam sel.  Sel-sel yang heterogen dapat disebabkan oleh komposisi media tumbuh dan masa kultur yang panjang.  Tekstur kalus : meremah (friabel) dan kompak.  Warna kalus : putih, kekuningan, hijau dan coklat.

 Organogenesis tak langsung pada daun kumis kucing (Orthosipon sp.) kalus → tunas  Kalus dari kultur kalus dapat digunakan untuk :  Perbanyakan tanaman secara tak langsung melalui organogenesis atau embriogenesis  Bahan inokulum untuk kultur suspensi sel  Mendapatkan metabolit sekunder

 Organogenesis tak langsung pada daun kumis kucing (Orthosipon sp.) : kalus → akar

 Kalus perlu di subkultur : memindahkan kalus ke media baru secara teratur dalam jangka waktu tertentu.  Tujuan subkultur :  Menghindari terjadinya kehabisan hara dan air  Menghindari terjadinya penghambatan pertumbuhan kalus oleh senyawa metabolik yang dihasilkan  Interval waktu subkultur sangat tergantung pada kec. tumbuh kalus, berkisar 2-4 minggu  Masa kultur yang lama menyebabkan habituasi, perubahan siklus sel dan mitosis.

 Ukuran inokulum untuk subkultur : diameter 5 – 10 mm atau 20 – 100 gram.  Pada kultur kalus dapat dibuat kurva pertumbuhan kalus, membentuk kurva sigmoid.  Tanaman dpt beregenerasi dari sel- sel yang tak terdeferensiasi, disebut rediferensiasi. Redeferensiasi untuk membentuk akar dan tunas.

 Kultur sel bebas atau agregat sel kecil dalam media cair dengan pengocokan  Umumnya diinisiasi dari kalus. Kalus pda media padat bersifat asinkronus, shg perlu sinkronisasi.  Dapat digunakan untuk mempelajari metabolisme sel, diferensiasi sel dan senyawa-senyawa metabolit yang dihasilkan sel.

 Kultur suspensi digunakan sebagai sumber :  Sel untuk protoplasma  Sel yang akan diberi diperlakuan mutagen kimia  Sel untuk studi hubungan host-patogen dalam fitopatologi  Massa untuk produksi metabolit sekunder.  Inisiasi kultur suspensi diawali dengan menginokulasikan kalus segar mg ke dalam 40 mL media yang ditempatkan pada erlenmeyer 125 mL.  Kultur dipelihara dengan meletakkan wadah di atas pengocok berupa “shaker” dengan kecepatan putaran berkisar rpm.

 Tujuan pengocokan :  Pemecahan gumpalan sel menjadi agregat kecil dan sel tunggal  Distribusi sel yang merata dalam media  Pertukaran gas antara media dan udara  Jenis kultur suspensi :  Kultur Batch : kultur dalam media hara dengan volume tetap, konsentrasi hara berubah sesuai tingkat pertumbuhan sel.  Kultur Continous : kultur sel jangka panjang dengan suplai hara yang konstan dalam wadah besar.

Kultur continous ada 2 tipe : 1. Kultur tertutup (closed type) : sel bertambah terus tanpa dipanen, hanya media yang disirkulasi. 2. Kultur terbuka (open type) : penambahan media baru disertai dengan panen sel.Alat berupa chemostat atau turbidostat. Subkultur dilakukan setiap 1-2 minggu tergantung kecepatan pertumbuhan sel.

Keuntungan kultur Suspensi : -tidak ada gradien nutrisi dan gas -Semua permukaan sel kontak dgn medium -Aerasi lebih baik -Tidak ada akumulasi senyawa toksik Derajat dispersi dipengaruhi rasio auksin yang lebih tinggi dari sitokinin. Kultur suspensi tumbuh cepat shg perlu disubkultur.

 Cara subkultur : sel diendapkan, medium dituang dengan hati-hati. Endapan sel dibagi ke dalam 2 medium baru dgn komposisi dan volume sama dengan medium lama.  Subkultur dilakukan pd awal fase stasioner.  Metode untuk mengukur laju pertumbuhan sel : Jumlah sel termampat, jumlah sel, BB dan BK.  Pengukuran pada interval waktu tertentu.

Hasil pengukuran diplotkan dengan waktu akan menghasilkan kurva pertumbuhan sigmoid dengan 5 fase yaitu lag, eksponensial, linear, penurunan cepat dan stasioner Fase lag : tahap persiapan membelah Fase eksponensial : laju pembelahan maksimal. Fase linear : pembelahan melambat, pembentangan sel cepat. Fase stasioner : sel tdk membelah lagi.

 Kultur sel yang sinkronus adalah : sebagian besar sel melewati setiap fase dari siklus sel (G1, S, G2, M) secara bersamaan.  Metode untuk sinkronisasi : 1.Starvation. Menahan sel pada G1 atau G2 dgn starvasi hormon atau nutrien shg sel berada pada fase stasioner. - Subkultur pd medium kaya nutrisi dan hormon shg sel membelah secara sinkron.

 2. Penghambatan.  Penghambatan sintesis DNA dgn hydroxyurea, thymidine atau amphydicolin.  Siklus hanya sampai pada G1 dan semua sel terkumpul pada batas antara G1 dan S.  Penghilangan inhibitor membuat sel membelah sinkron.