POLYMERASE CHAIN REACTION Amplifikasi DNA

POLYMERASE CHAIN REACTION Tehnik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode amplifikasi (penggandaan) fragmen DNA secara in vitro. PCR merupakan proses yang berulang dan terdiri dari tiga tahapan utama: Denaturasi DNA template menggunakan pemanasan Annealing atau penempelan primer (berupa oligonukleotida rantai tunggal dan pendek) Extension atau pemanjangan primer menggunakan enzim taq polimerase

Komponen Esensial Proses Polymerase Chain Reactions Enzim DNA polymerase (taq polymerase) yang tahan dan stabil pada suhu tinggi untuk mengkatalisis terjadinya proses elongasi primer pada DNA template. Primer (tunggal atau sepasang oligonukleotida rantai pendek untuk menginisiasi terjadinya proses ekstension oleh enzim taq polymerase. Deoxynucleoside triphosphates (dATP, dTTP, dCTP, and dGTP) berupa basa nitrogen yang dibutuhkan dalam proses PCR Kofaktor enzim taq polymerase (MgCl2) Buffer untuk mempertahankan pH (Buffer TAE atau TBE untuk mempertahankan pH 8,3 – 8,8 pada suhu ruangan) Template DNA (cetakan molekul DNA dalam proses PCR)

Siklus PCR

50ºC 96ºC 50ºC 72ºC A. Double strand DNA B. Denaturasi Template C. Penempelan primer 50ºC Taq D. Penempelan enzim taq polymerase 72ºC Taq

Siklus I, sintesis DNA menghasilkan 4 rantai DNA Taq 72ºC Taq E. Ekstension (sintesis DNA) Taq Taq 1 2 3 4 F. Denaturasi DNA Template 96ºC Siklus I, sintesis DNA menghasilkan 4 rantai DNA

1 2 G. Penempelan Primer 50ºC 3 4

1 Taq 72ºC 2 H. Penempelan enzim taq polymerase 3 4

Siklus II, sintesis DNA menghasilkan 8 rantai DNA 1 Taq 72ºC 2 Taq I. Ekstension (Sintesis DNA) 3 Siklus II, sintesis DNA menghasilkan 8 rantai DNA Taq Taq 4

1 J. Denaturasi pada suhu 96ºC dan Annealing (penempelan) primer pada suhu 50ºC 2 3 4

Siklus III, sintesis DNA menghasilkan 16 rantai DNA 72ºC K. Penempelan enzim taq polymerase (tidak ditunjukan) and sintesis DNA 2 3 Siklus III, sintesis DNA menghasilkan 16 rantai DNA 4

1 L. Denaturasi pada suhu 96ºC dan Annealing (penempelan) primer pada suhu 50ºC 2 3 4

Siklus III, sintesis DNA menghasilkan 32 rantai DNA 1 M. Sintesis DNA pada suhu 72oC 72oC 2 3 Siklus III, sintesis DNA menghasilkan 32 rantai DNA 4

DNA copy (32) sekarang disajikan sebagai garis 1 DNA copy (32) sekarang disajikan sebagai garis 2 3 4

1 Setelah 5 siklus, terdapat 32 untaian ganda yang 24 (75%) memiliki ukuran yang sama 2 3 4

Cara kerja PCR terinspirasi dari cara kerja proses Replikasi DNA

Reverse Transcriptase-PCR Reverse transcriptase (RT)-PCR adalah amplifikasi fragmen DNA yang diperoleh dari fragmen mRNA. Produk yang dihasilkan adalah cDNA.

Reverse Transcriptase-PCR

Konversi mRNA menjadi cDNA menggunakan enzim Reverse Transcriptase Primer Oligo dT primer menempel pada mRNA AAAAA RT TTTTT Enzim Reverse transcriptase (RT) mensintesis rantai cDNA pertama AAAAA TTTTT RT Enzim Reverse transcriptase menempel kembali mRNA and mensintesis cDNA selanjutnya RT AAAAA TTTTT Terbentuk double strand cDNA Konversi mRNA menjadi cDNA menggunakan enzim Reverse Transcriptase

TERIMA KASIH