Alat Tissue Prosesor dan Microtome untuk pembuatan PA Agnes Geovani.A.G 12190860N Nanang Adi Wibowo 12190885N Rina Astuti 12190893N

Automatic Tissue Processor alat memproses jaringan pada Histoteknik (proses preparat histologi) setelah melalui di fiksasi. Tujuan :mengolah jaringan agar proses mikrotom sempurna. Automatic Tissue Processor

alat yang secara otomatis melakukan gerakan melakukan proses persiapan jaringan dengan timer yang sudah di setting. Prinsip Kerja Alat

Tissue Processor terdiri dari beberapa tahap yaitu Dehidrasi Clearing Infiltrasi Paraffin

Tahap menghilangkan/menarik air dalam jaringan dengan merendam dalam alkohol bertingkat (konsentrasi terendah sampai tinggi) DEHIDRASI

Untuk menarik keluar alcohol yang berada dalam jaringan, menggunakan xylol. Karena alcohol tidak dapat berikatan dengan paraffin Clearing

Tahapan terakhir yaitu Infiltrasi paraffin, tahap pengisian pori-pori jaringan dengan paraffin.

Alat untuk memotong / mengiris spesimen menjadi sangat tipis, 3-5 mikron untuk pemeriksaan mikroskopis Mikrotom

PRINSIP MIKROTOM Blok parafin bergerak vertikal maju, sampai bersentuhan dengan pisau pemotong. PRINSIP MIKROTOM

Jenis-jenis mikrotom : Mikrotom geser Mikrotom klinis beku Mikrotom putar Mirotom sayatan ultra tipis Mikrotom base sledge Mikrotom smith dan farquhar Mikrotom faust Jenis-jenis mikrotom :

Jenis – jenis mikrotom yang umun digunakan : Mikrotom geser (sliding microtome) Untuk sayatan nitrroselulose atau palstik. Kekurangan : mahal, sayatan kurang bagus. Untuk jaringan keras dan besar misal mata,tulang dan kartilago Jenis – jenis mikrotom yang umun digunakan :

Mikrotom klinis beku (freezing microtome) Untuk keperluan diagnosis yang bersifat segera. Mendiagnosis komponen sel tertentu seperti lemak dan enzim. Keuntungan : waktu yang dipakai lebih pendek, karena langsung disayat setelah fiksasi. Kerugian: bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak,sulit dipotong Mikrotom putar (rotary microtome). Umum digunakan dilaboratorium, baik untuk sayatan paraffin maupun teknik Cryostat dan tahan karat Pisau: tipe wedge knife

Mikrotom sayatan ultra tipis (ultra-thin microtome) Metode ultramicrotomy. Ketebalan sayatan dengan 1 milimikron (untuk mikroskop elektron). Jenis pisau: diamond knives Mikrotom faust  Instrument ini berukuran kecil, ketebalan sayatan maksimum 25 milimikron.

Mikrotom base sledge Untuk menyayat jaringan dengan ukuran yang sangat besar misal: otak Ukurannya besar dan berat Jenis pisau: wedge atau planar Mikrotom smith dan Farquhar Untuk menyayat jaringan segar (yang tidak difiksasi atau dibekukan) dengan tingkat kerusakan struktur halus dan kehilangan aktivitas enzimatik yang sangat minimal. ketebalan sayatan 5 -230 milimikron, kecepatan antara 50-200 sayatan permenit

Komponen mikrotom yang paling berperan adalah….. Pisau Mikrotom 

tiga tipe pisau mikrotom, yaitu: 1.Planar Concave Sangat tajam, dapat menghasilkan potongan sampel sangat lembut dan tipis. 2.Wedge Profile Knives Bentuknya lebih seimbang, untuk memotong sampel yang cukup keras 3.Chisel Profil Bentuk mata pisau tumpul, stabil bentuk potongan, ukuran potongan relatif besar tiga tipe pisau mikrotom, yaitu:

Mekanisme Kerja Mikrotom Persiapan sebelum pemotongan : Pisau mikrotom diletakan pada tempatnya dengan sudut 45° Kaca objek dilengkapi dg identitas pasien. Persiapan Waterbath suhu 40-45°C  Spatel pipih Kuas.  Mekanisme Kerja Mikrotom

Rekatkan blok parafin di mikrotom kemudian diletakkan pada pemegangnya (holder) pada mikrotom dan dikunci dengan kuat.  tata sudut kemiringannya pisau mikrotom. Tata ketebalan potongan gerakkan blok preparat ke arah pisau sedekat mungkin, lakukan triming, buang pita-pita parafin tanpa jaringan, kemudian potong blok preparat secara teratur dan ritmis sampai kita mendapatkan potongan yang mengandung preparat jaringan Tehnik pemotongan parafin yang mengandung preparat yaitu sebagai berikut: 

Pita parafin yang mengandung jaringan dialihkan hati-hati dengan sengkelit kedalam waterbath dengan suhu 40-45°C, biarkan sampai mengembang.  Setelah mengembang tempelkan kaca objek dengan cara memasukkan kaca objek itu kedalam waterbath dan menggerakkannya ke arah pita parafin. hati-hati agar pita parafin tidak melipat Letakkan kaca objek di atas hotplate dengan temperatur 40-45C Setelah air kering, saatnya untuk diwarnai

Perawatan mikrotom : Mikrotom ditutup (terhindar dari debu) Jangan memindahkan mikrotom dengan memegang bagian yang dapat bergerak (menggangu akurasi) Dibersihkan sebelum dan sesudah digunakan, dengan kain lap dibasahi xilol. Mikrotom harus diminyaki, mencegah keausan dan kemacetan. Perawatan mikrotom :

Perawatan Pisau Mikrotom Dibersihkan dengan kertas atau kain pembersih lensa yang dibasahi xilen setelah dipakai, jika tidak akan korosi. Pisau harus ditajamkan sesering mungkin. Dengan teknik : mengikir (honing) mengasah (stropping) Perawatan Pisau Mikrotom

Pemeriksaan sitologi JENIS SAMPEL SITOLOGI : Sitologi adalah ilmu yang mempelajari morfologi sel-sel cairan tubuh. JENIS SAMPEL SITOLOGI : Efusi pleura Acites sputum Eksfoliatif Cervical smear Bronchial Aspirasi jarum halus Non Eksfoliatif Pemeriksaan sitologi

Ketepatan pengambilan Metode fiksasi yang benar Cara pengepakan dan pengiriman sampel Prosesing sitologi terutama pewarnaan sel. Faktor-faktor yang perlu diperhatikan untuk keberhasilan pemeriksaan sitologi

Yang harus diperhatikan dalam pembuatan sitologi dan fiksasinya   Yang harus diperhatikan dalam pembuatan sitologi dan fiksasinya

Fiksasi langsung ialah fiksasi pada sediaan smear / apusan Contohnya : Pap smear , FNAB yang langsung dibuat smear/apusan. Fiksasi tidak langsung Ialah fiksasi yang dilakukan pada bahan/cairan yang tidak segera di buat sediaan. Contohnya: C. ascites, C.pleura Metode fiksasi

Fiksasi dasar untuk pemeriksaan Sitologi Pewarnaan Papanicolaou Preparat apus difiksasi langsung ke alkohol 95 % tanpa menunggu kering. Untuk Pap smeardan FNAB minimal 15 menit, apusan cairan minimal 1 jam Pewarnaan Giemsa Preparat apus harus benar-benar kering, kemudian difiksasi minimal 5 menit. Fiksasi dasar untuk pemeriksaan Sitologi

bertujuan untuk identifikasi morfologi sel, inti sel maupun sitoplasma sel, sehingga bisa memberikan gambaran menyeluruh kondisi morfologi sel yang diperiksa Teknik pewarnaan untuk standar pemeriksaan sitologi, yaitu : PewarnaanPapanicolaou Pewarnaan Giemsa Teknik pewarnaan

Pewarnaan Papanicolaou Terdapat lima langkah utama dalam metode pewarnaan Papanicolaou yaitu : Fiksasi Pewarnaan inti Pewarnaan sitoplasma Penjernihan (clearing) Mounting Pewarnaan Papanicolaou

Pewarnaan dengan larutan Giemsa Langkah – langkah dalam pewarnaan Giemsa: a.Fiksasi Pewarnaan dengan larutan Giemsa Mounting Pewarnaan Giemsa

PEMBUATAN PREPARAT HISTOLOGI

PEMBUATAN PREPARAT HISTOLOGI HISTOLOGI - NORMAL HISTOPATOLOGI- PATOLOGIS Sesuai komponen jaringan hewan yang sehat Jaringan/sel yang mengalami perubahan patologis diantaranya : degenerasi, nekrosis, peradangan, gangguan sirkulasi, gangguan pertumbuhan, neoplasia, imunopatologis, parasitik

Pembacaan preparat Interpretasi hasil - Diagnosa Nekropsi Pengambilan jaringan Pembacaan preparat Interpretasi hasil - Diagnosa Ketepatan fixative Ketepatan proses pembuatan preparat

TAHAP PEMBUATAN PREPARAT FIXASI – neutral buffer formalin 10% (NBF) TRIMING – diperkecil – masuk di tissue cassete DEHIDRASI- Tissue procesor EMBEDING –BLOKING - parafin CUTTING - mikrotom STAINING – Hematoxylin-Eosin (HE) MOUNTING– cover slip - EXAMINED

1. FIKSASI Tujuan dari fiksasi : Mempertahankan bentuk dan integritas kimiawi sel sesuai pada saat hidup. Mencegah kerusakan bentuk, struktur dan hubungan antar sel akibat dari pembusukan dan perpindahan dari satu tempat ke tempat lain. Memperkeras jaringan agar terhindar dari traumatik atau akibat handling.

Pertimbangan fixative: Kecepatan – ukuran jaringan Penetrasi – Jenis jaringan Volume – volume 10-20 ukuran jaringan Lama fixasi – pilih fixative sesuai kebutuhan NBF: Formalin 10% ............................... 1000 ml Sodium acid phosphate ................ 4 g Anhidrous disodium phosphate ...6,5 g

Fiksasi ….. Target Fixative of choice Fixative to avoid Proteins Neutral buffered formalin, paraformaldehyde Osmium tetroxide Enzymes Frozen sections Chemical fixatives Lipids Frozen sections*, glutaraldehyde/osmium tetroxide Alcoholic fixatives, neutral buffered formalin Nucleic acids Alcoholic fixatives Aldehyde fixatives Mucopolysaccharides Biogenic amines Bouin solution, neutral buffered formalin Glycogen Alcoholic based fixatives

2. TRIMING Triming berarti mengiris-iris jaringan menjadi lebih kecil yang bertujuan agar bisa dimasukkan dalam tissue cassete untuk proses dehidrasi Dalam melakukan triming sangat penting diperhatikan bagian jaringan yang mana akan dipilih, sehingga menunjang akurasi diagnosa

2. TRIMING

Xylol 2 – 2 jam Parafin cair I – 2 jam Parafin cair II- 2 jam 3. DEHIDRASI Proses dehidrasi meliputi : Perendaman dalam alkohol 70% - 2 jam Alkohol 80% - 2 jam Alkohol 90% 2 jam Alkohol 96% - 2jam Alkohol absolut I – 2 jam Alkohol absolut II – 2 jam Toluena I – 2 jam Toluena II – 2 jam Xylol 1 – 2 jam Xylol 2 – 2 jam Parafin cair I – 2 jam Parafin cair II- 2 jam

Tissue processor

4. Embeding + Blocking 25/02/2018

5. CUTTING/SECTIONING Menggunakan mikrotom – berbagai merk Ketebalan pemotongan : 4-6 µm Dekat dengan waterbath 56oC, untuk tempat pengembangan potongan jaringan Jika sudah mengembang, tangkap jaringan dengan objek glas. Dikeringkan dalam suhu kamar, kemudian masukkan dalam inkubator sebelum diwarnai.

Ketajaman pisau mikrotom 5. CUTTING/SECTIONING …… Ketajaman pisau mikrotom Pisau ada 2 jenis tgt pada type mikrotom Pisau yang tebal – diasah secara periodic Pisau yang tipis – diganti langsung jika hasil potongannya tdk bagus.

Cutting dg Mikrotom …

Cutting dg Mikrotom

6. STAINING (PEWARNAAN ROUTINE – HE) preparat pada direndam dalam xylol I , II dan III selama masing-masing 5 menit dehidrasi dengan etanol I dan II masing-masing 5 menit Cuci dengan aquades 1 menit Rendam dalam larutan Hematoksilin selama 15 menit, selanjutnya dibilas dengan air mengalir, lalu dicuci dengan Lithium karbonat selama 15-30 detik, dibilas dengan aquades 1 menit Celupkan dalam acid alkohol 4 celupan, kemudian bilas dengan akuades 1 menit & 15 menit diwarnai dengan Eosin selama 4 menit. Sediaan di masukan dalam alkohol 70%, 80%,dan 96% masing-masing selama 3 menit. Selanjutnya rendam ke dalam etanol III dan IV masing-masing selama 3 menit Selanjutnya dalam xylol IV dan V masing-masing 3 menit Sediaan dikeringkan dan diteteskan dengan perekat permount dan ditutup dengan gelas penutup

Staining

7. PEMBACAAN PREPARAT

DIAGNOSA MORFOLOGIK MAKROSKOPIK MIKROSKOPIK Pembesaran Mengecil White spot Perdarahan Cacing Degenerasi, nekrosis, imflamasi, neoplasia Atrofi, fibrosis, fisiologis Nekrosis, infark, migrasi larva Fokal, multifokal, difusa Larva migran, edema

PEWARNAAN KHUSUS

Pewarnaan Khusus ….. Lema k : Oil red O Sudan III Sudan Black

TERIMAKASIH