Signaling from Plastid Genome Stability Modulates Endoreplication and Cell Cycle during Plant Development Oleh: Nama : Azmi Wijayanti Harahap NIM: Oleh: Nama : Azmi Wijayanti Harahap NIM: Sujuan Duan, Lili Hu, Beibei Dong, Hong-Lei Jin, and Hong-Bin Wang, State Key Laboratory of Biocontrol and Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou, People’s Republic of China 2Institute of Medical Plant Physiology and Ecology, School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, People’s Republic of China

Duan dkk. menunjukkan bahwa ketidakstabilan genom plastid memodulasi endoreplikasi dan perkembangan siklus sel oleh pensinyalan retrograde plastid ke nukleus melalui jalur yang dimediasi SOG1, yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan tanaman.  Ketidakstabilan genom plastid mengubah endoreplikasi dan siklus sel  Ketidakstabilan genom plastid menghasilkan peningkatan ekspresi gen terkait siklus sel  SOG1 memediasi aktivasi gen terkait siklus sel dengan ketidakstabilan genom plastid  ROS diperlukan untuk komunikasi genom plastid dengan endoreplikasi dan siklus sel  Ketidakstabilan genom plastid mengubah endoreplikasi dan siklus sel  Ketidakstabilan genom plastid menghasilkan peningkatan ekspresi gen terkait siklus sel  SOG1 memediasi aktivasi gen terkait siklus sel dengan ketidakstabilan genom plastid  ROS diperlukan untuk komunikasi genom plastid dengan endoreplikasi dan siklus sel

INTRODUCTION Fungsi genom yang tepat tergantung pada pemeliharaan integritas genom. Plastida tanaman adalah organel semi-otonom yang mengandung genomnya sendiri, mengkode beberapa protein yang diperlukan untuk pembentukan kompleks fotosintesis dan metabolisme fungsional. Stabilitas genom plastid sangat penting untuk fungsi plastid dan akibatnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Namun, plastida sangat sensitif terhadap kondisi dan rangsangan lingkungan tertentu yang dapat merusak stabilitas genomnya; khususnya, double-strand break (DSB) dianggap paling mengancam ketidakstabilan genom. Secara spontan, plastid genome-damaging agent ciprofloxacin (CIP) adalah inhibitor gyrase yang juga dapat menghasilkan DSB organel yang menginduksi penyusunan ulang plastid DNA (ptDNA) yang parah jika tidak diperbaiki dengan benar. Beberapa faktor yang terlibat dalam pemeliharaan stabilitas genom plastid telah diidentifikasi pada Arabidopsis thaliana: protein pengikat DNA untai tunggal WHIRLY (WHY) 1 dan WHY3 ditargetkan ke plastid dan melindungi genom plastid terhadap penataan ulang ; kloroplas RECA1 adalah kunci untuk rekombinasi homolog (HR) dan pemeliharaan integritas struktural genom plastid ; dan polimerase tipe I, PolIB, melakukan replikasi dan perbaikan ptDNA pada Arabidopsis. Ketidakstabilan genom plastid Arabidopsis polibwhy1why3 mutan rangkap tiga mengarah pada generasi reactive oxygen species (ROS) dan menginduksi pemrograman ulang genetik nukleus terkait stres, yang berkorelasi dengan daun beraneka warna kuning dan adaptasi stres lingkungan.

INTRODUCTION Lebih dari 95% protein plastid dikodekan oleh genom nukleus, yang berisi semua informasi genetik yang diperlukan untuk fungsi plastid dan kelangsungan hidup tanaman. Namun, ketidakstabilan genom dapat terjadi akibat kegagalan pada langkah yang berbeda dari siklus DNA (dari replikasi ke segregasi) dan kegagalan atau perbaikan kerusakan DNA yang tidak tepat. Ketika kerusakan DNA tidak dapat diperbaiki, tanaman memulai kematian sel untuk menghindari transmisi DNA yang rusak ke generasi berikutnya. Namun, jika kerusakan DNA minimal, maka tanaman mengaktifkan penghentian siklus sel, endoreplikasi, dan perbaikan kerusakan DNA untuk memastikan integritas genom. Penangkapan siklus sel di pos pemeriksaan pengawasan utama, G1/S dan G2/M, memungkinkan sel mengambil tindakan untuk mengatasi kerusakan DNA. Selama endoreplikasi, replikasi DNA berlanjut tanpa pembelahan sel untuk memastikan kelangsungan hidup tanaman. Dalam penelitian ini, dilakukan mengeksplorasi hubungan antara keadaan plastid dan genom nukleus. Ditemukan bahwa ketidakstabilan genom plastid mempengaruhi status genom nukleus yang dimediasi oleh SOG1 melalui pengaktifan gen yang terlibat dalam meningkatkan endoreplikasi dan regulasi siklus sel. Penelitian ini selanjutnya mengungkapkan bahwa komunikasi genom nukleus plastid melibatkan peningkatan ROS, sehingga mengendalikan pertumbuhan dan perkembangan tanaman.

RESULTS Ketidakstabilan Genom Plastid Memodulasi Endoreplikasi dan Siklus Sel. Hasil penelittian menunjukkan bahwa ketidakstabilan genom plastid dengan penataan ulang ptDNA yang parah memodulasi endoreplikasi dan perkembangan siklus sel pada tanaman. Endoreplikasi dan Siklus Sel diubah dalam genom mutan reca1why1why3 Hasil menunjukkan bahwa ketidakstabilan genom plastid tidak secara langsung merusak DNA nikleus dan memicu perbaikan DNA, serta kematian sel; sebaliknya dapat mempengaruhi status genom nukleus dengan mengganggu endoreplikasi dan perkembangan siklus sel. Pembelahan Sel dan Perkembangan Embrio Terganggu di mutan Reca1why1why3 Hasil menunjukkan bahwa perkembangan embrio terganggu pada mutan reca1why1why3n. Secara keseluruhan, perkembangan yang abnormal pada daun dan embrio kemungkinan disebabkan oleh cacat pada pembelahan sel dan siklus sel, yang selanjutnya mendukung bahwa ketidakstabilan genom plastid memodulasi endoreplikasi dan perkembangan siklus sel.

RESULTS Inhibitor Kinase Siklus Sel SMR5 dan SMR7 Diperlukan untuk Regulasi Endoreplikasi dan Siklus Sel oleh Ketidakstabilan Genom Plastid Inhibitor Kinase Siklus Sel SMR5 dan SMR7 Diperlukan untuk Regulasi Endoreplikasi dan Siklus Sel oleh Ketidakstabilan Genom Plastid Hasil menunjukkan bahwa perubahan perkembangan siklus sel pada tanaman akibat ketidakstabilan genom plastid mungkin disebabkan oleh peningkatan ekspresi gen pada siklus sel. SOG1 Penting untuk Aktivasi Gen Terkait Siklus Sel oleh Instabilitas Genom Plastid SOG1 Penting untuk Aktivasi Gen Terkait Siklus Sel oleh Instabilitas Genom Plastid Hasil ini menunjukkan bahwa SOG1 memainkan peran penting dalam mengatur endoreplikasi dan ekspresi gen terhadap siklus sel pada mutan reca1why1why3. ROS Berperan dalam Komunikasi Ketidakstabilan Genom Plastid dengan Endoreplikasi dan Siklus Sel ROS Berperan dalam Komunikasi Ketidakstabilan Genom Plastid dengan Endoreplikasi dan Siklus Sel Hasil menunjukkan bahwa ROS terkolokalisasi dengan protein nukleus plastid, PEND, sebagian pada mutan reca1why1why3, yang menunjukkan bahwa ROS sebagian besar terakumulasi dalam plastida tanaman akibat ketidakstabilan genom plastid.

Gambar. Analisis nukleus dan Ekspresi DNA dari CYCB1;1 padaTanaman yang diberi perlakuan Novobiocin (NOV)- atau Ciprofloxacin (CIP)- Gambar. Analisis nukleus dan Ekspresi DNA dari CYCB1;1 padaTanaman yang diberi perlakuan Novobiocin (NOV)- atau Ciprofloxacin (CIP)- (A) Representasi skematis dari mekanisme fungsi dan konsekuensi NOV atau CIP. Dalam kondisi normal (tidak ada perlakuan yang diberikan), replikasi genom plastid normal; dibawah kondisi NOV, replikasi ptDNA berhenti; dan dibawah kondisi CIP, replikasi ptDNA berhenti dan penataan ulang ptDNA meningkat. (B dan C) Distribusi ploidi (B) dan kandungan DNA nukleus (C) tanaman WT atau WT berumur 14 hari yang diberi NOV (10, 15, 50, dan 100mM). Dengan 3 ulangan. (A) Representasi skematis dari mekanisme fungsi dan konsekuensi NOV atau CIP. Dalam kondisi normal (tidak ada perlakuan yang diberikan), replikasi genom plastid normal; dibawah kondisi NOV, replikasi ptDNA berhenti; dan dibawah kondisi CIP, replikasi ptDNA berhenti dan penataan ulang ptDNA meningkat. (B dan C) Distribusi ploidi (B) dan kandungan DNA nukleus (C) tanaman WT atau WT berumur 14 hari yang diberi NOV (10, 15, 50, dan 100mM). Dengan 3 ulangan.

Gambar. Analisis nukleus dan Ekspresi DNA dari CYCB1;1 pada Tanaman yang diberi perlakuan Novobiocin (NOV)- atau Ciprofloxacin (CIP)- Gambar. Analisis nukleus dan Ekspresi DNA dari CYCB1;1 pada Tanaman yang diberi perlakuan Novobiocin (NOV)- atau Ciprofloxacin (CIP)- (D) Analisis ekspresi CYCB1;1 pada WT atau WT berumur 14 hari yang diberi perlakuan dengankonsentrasi NOV yang berbeda. 3 ulangan (E dan F) Distribusi ploidi (E) dan kandungan DNA nukleus (F) tanaman WT atau WT berumur 14 hari yang diberi perlakuan CIP (0,25, 0,5, 0,75, dan 1mM). 3 ulangan. (G) Analisis ekspresi dari CYCB1;1 pada WT atau WT berumur 14 hari yang diberi perlakuan dengan konsentrasi CIP yang berbeda. Tingkat transkrip setiap gen dinormalisasi relatif terhadap ACTIN2 (Di3g18780). Data di (C), (D), (F), dan (G) adalah rata-ratanya± SE (n = 3). 3 ulangan (**p <0,01; Uji t Student). (D) Analisis ekspresi CYCB1;1 pada WT atau WT berumur 14 hari yang diberi perlakuan dengankonsentrasi NOV yang berbeda. 3 ulangan (E dan F) Distribusi ploidi (E) dan kandungan DNA nukleus (F) tanaman WT atau WT berumur 14 hari yang diberi perlakuan CIP (0,25, 0,5, 0,75, dan 1mM). 3 ulangan. (G) Analisis ekspresi dari CYCB1;1 pada WT atau WT berumur 14 hari yang diberi perlakuan dengan konsentrasi CIP yang berbeda. Tingkat transkrip setiap gen dinormalisasi relatif terhadap ACTIN2 (Di3g18780). Data di (C), (D), (F), dan (G) adalah rata-ratanya± SE (n = 3). 3 ulangan (**p <0,01; Uji t Student).

Gambar. Konten DNA nukleus dan Ekspresi CYCB1;1 Diubah pada mutan reca1why1why3 (A) Representasi skematis dari fungsi faktor stabilitas genom plastid dan konsekuensi dari mutan reca1why1why3. Pada tanaman WT, replikasi genom plastid adalah normal; pada mutan reca1why1why3 penataan ulang ptDNA meningkat. (B dan C) Distribusi ploidi (B) dan kandungan DNA nukleus (C) pada WT umur 14 hari dan mutan reca1why1why3. 3 ulangan. (D) Analisis ekspresi CYCB1;1 pada WT berumur 14 hari dan mutan reca1why1why3. Tingkat transkrip dari CYCB1;1 dinormalisasi relatif terhadap ACTIN2 (At3g18780).

Gambar. Konten DNA nukleus dan Ekspresi CYCB1;1 Diubah pada mutan reca1why1why3 (E) Analisis uji komet tentang status kerusakan DNA yang diberi perlauan H2O pada tanaman WT dan reca1why1why3- yang berumur 14 hari. Bilah skala, 50um. Data statistik untuk DNA di ekor komet di sebelah kanan adalah rata-rata SE(n=60) dari 3ulangan. (F) gen analisis qPCR yang terlibat dalam berbagai jalur perbaikan DNA tanaman berumur 7 hari. Tanaman yang diberi perlakuan H2O2- digunakan sebagai kontrol. (G) Foto representatif daun dari tanaman berumur 25 hari yang tumbuh dalam kondisi normal dan diwarnai dengan trypanblue. Bilah skala500um. 3ulangan Data di (C), (D), dan (F) mewakili mean±SEs (n = 3) dari 3 ulangan (*p <0,05, **p <0,01; ***p <0,001; Uji t). (E) Analisis uji komet tentang status kerusakan DNA yang diberi perlauan H2O pada tanaman WT dan reca1why1why3- yang berumur 14 hari. Bilah skala, 50um. Data statistik untuk DNA di ekor komet di sebelah kanan adalah rata-rata SE(n=60) dari 3ulangan. (F) gen analisis qPCR yang terlibat dalam berbagai jalur perbaikan DNA tanaman berumur 7 hari. Tanaman yang diberi perlakuan H2O2- digunakan sebagai kontrol. (G) Foto representatif daun dari tanaman berumur 25 hari yang tumbuh dalam kondisi normal dan diwarnai dengan trypanblue. Bilah skala500um. 3ulangan Data di (C), (D), dan (F) mewakili mean±SEs (n = 3) dari 3 ulangan (*p <0,05, **p <0,01; ***p <0,001; Uji t).

(A) Daun roset WT dan tanaman mutan mulai dari yang paling tua (kiri) sampai yang paling muda (kanan). Bilah skala, 0,5 cm. (B) Analisis mikroskop elektron pemindaian sel-sel epidermis pada permukaan adaksial dari daun yang berdiferensiasi penuh dari WT berusia 25 hari dan mutan reca1why1why3. Bilah skala, 50mm. (C dan D) Perbandingan luas daun (C) dan luas sel epidermis (D) antara WT dan mutan. (E) Bibit WT dan mutan. Bilah skala, 0,2 cm. (F) Analisis mikroskopis kontras interferensi diferensial (DIC) dari benih WT dan mutan. Bilah skala, 50mm. Setidaknya 3 ulangan dilakukan untuk setiap percobaan. (G) Kesuburan benih tanaman WT dan reca1why1why3. Data adalah rata-rata SE (n = siliques) dari 3 ulangan (H) Perbandingan berat butir untuk WT dan mutan reca1why1why3. (A) Daun roset WT dan tanaman mutan mulai dari yang paling tua (kiri) sampai yang paling muda (kanan). Bilah skala, 0,5 cm. (B) Analisis mikroskop elektron pemindaian sel-sel epidermis pada permukaan adaksial dari daun yang berdiferensiasi penuh dari WT berusia 25 hari dan mutan reca1why1why3. Bilah skala, 50mm. (C dan D) Perbandingan luas daun (C) dan luas sel epidermis (D) antara WT dan mutan. (E) Bibit WT dan mutan. Bilah skala, 0,2 cm. (F) Analisis mikroskopis kontras interferensi diferensial (DIC) dari benih WT dan mutan. Bilah skala, 50mm. Setidaknya 3 ulangan dilakukan untuk setiap percobaan. (G) Kesuburan benih tanaman WT dan reca1why1why3. Data adalah rata-rata SE (n = siliques) dari 3 ulangan (H) Perbandingan berat butir untuk WT dan mutan reca1why1why3. Gambar 3. Perkembangan Sel Daun dan Perkembangan Embrio Terpengaruh pada mutan reca1why1why3

Gambar 4. Ekspresi Gen siklus Sel Ditingkatkan pada mutan reca1why1why3 (A) Analisis ekspresi dari SMR5 dan SMR7 pada tanaman WT dan Mutan reca1why1why3 yang diberi perlakuan CIP. Tingkat transkrip setiap gen dinormalisasi relatif terhadap ACTIN2 (Di3g18780). (B–E) Fenotipe (B), ukuran roset (C), distribusi ploidi (D), dan kandungan DNA nukleus (E) dari tanaman WT, smr7, reca1why1why3, dan quadruple tanaman smr7reca1why1why3 berumur 25 hari. Tanaman quadruple diisolasi dari populasi segregasi F4 yang dihasilkan oleh persilangan reca1why1why3 dengan smr7. (A) Analisis ekspresi dari SMR5 dan SMR7 pada tanaman WT dan Mutan reca1why1why3 yang diberi perlakuan CIP. Tingkat transkrip setiap gen dinormalisasi relatif terhadap ACTIN2 (Di3g18780). (B–E) Fenotipe (B), ukuran roset (C), distribusi ploidi (D), dan kandungan DNA nukleus (E) dari tanaman WT, smr7, reca1why1why3, dan quadruple tanaman smr7reca1why1why3 berumur 25 hari. Tanaman quadruple diisolasi dari populasi segregasi F4 yang dihasilkan oleh persilangan reca1why1why3 dengan smr7.

Gambar 5. Peran SOG1 dalam Modulasi Ploidi Sel dan Ekspresi Gen Terkait Siklus Sel yang Dipicu oleh Ketidakstabilan Genom Plastid (A) ChIP-qPCR menganalisis pengikatan SOG1 ke daerah promotor CYCB1;1, SMR5, dan SMR7 pada tanaman mutan reca1why1why3 dibandingkan dengan WT (B dan C). Distribusi ploidi (B) dan kandungan DNA nukleus (C) tanaman WT,sog1-1, dan sog1-101 berumur 14 hari yang diberi perlakuan dengan atau tanpa CIP. (D) Analisis ekspresi CYCB1;1 dan SMR7 pada tanaman WT, sog1-1, dansog1-101 berumur 14 hari yang diberi perlakuan dengan atau tanpa CIP. Tingkat transkrip setiap gen dinormalisasi relatif terhadap ACTIN2 (At3g18780). Untuk (A) dan (D), tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan (A) ChIP-qPCR menganalisis pengikatan SOG1 ke daerah promotor CYCB1;1, SMR5, dan SMR7 pada tanaman mutan reca1why1why3 dibandingkan dengan WT (B dan C). Distribusi ploidi (B) dan kandungan DNA nukleus (C) tanaman WT,sog1-1, dan sog1-101 berumur 14 hari yang diberi perlakuan dengan atau tanpa CIP. (D) Analisis ekspresi CYCB1;1 dan SMR7 pada tanaman WT, sog1-1, dansog1-101 berumur 14 hari yang diberi perlakuan dengan atau tanpa CIP. Tingkat transkrip setiap gen dinormalisasi relatif terhadap ACTIN2 (At3g18780). Untuk (A) dan (D), tanda bintang menunjukkan perbedaan yang signifikan

Gambar 6. Production Reactive Oxygen Species (ROS) pada mutan reca1why1why3 Mempengaruhi DNA Nukleus dan Ekspresi Gen Terkait Siklus Sel (A) Pewarnaan NBT (kiri 2 panel) untuk pewarnaan O2- dan DAB (kanan 2 panel) untuk H2O2 pada tanaman mutan WT dan mutan reca1why1why3 GL dan LL (batang skala: GL, 0,5 cm; LL, 500um). 2 ulangan (B) Fv/Fm dan ETR pada WT berumur 25 hari dan mengingat kembali tanaman reca1why1why3 yang tumbuh di bawah kondisi GL dan LL. 5 ulangan ( C ) penataan ulang ptDNA pada tanaman WT dan reca1why1why3 berumur 25 hari yang ditumbuhkan di bawah kondisi GL dan LL; tanda bintang merah menunjukkan peningkatan penataan ulang ptDNA pada tanaman reca1why1why3. Panah merah dan biru mewakili ukuran penanda DNA masing-masing dan 750 bp. 3 ulangan dan jalur yang tidak relevan antara GL dan LL dari 1 gel dihilangkan. (D–G) Analisis distribusi ploidi (D–F) dan kandungan DNA inti (G) pada tanaman reca1why1why3 berumur 25 hari dan WT di bawah GL (D) atau LL (E), atau tanaman yang diberi perlakuan asam askorbat (F). 3 ulangan, dengan hasil yang serupa. (H) Ekspresi dariCYCB1;1 dan SMR7 pada mutan reca1why1why3 dan tanaman WT pada kondisi LL atau mutan reca1why1why3 dan WT berumur 14 hari bibit ditanam dipiring dengan peningkatan konsentrasi asam askorbat (pemadam ROS, 0,5 dan 2 mM

Gambar 7. Model yang Diusulkan Menunjukkan Koordinasi antara Genom Plastid dan Genom Nukleus untuk Mendorong Pertumbuhan dan Perkembangan Tanaman Ketidakstabilan genom plastid, yang disebabkan oleh mutasi RECA1, WHY1, dan WHY3 atau oleh stres eksternal (misalnya, CIP), mendorong akumulasi ROS, yang ditransmisikan ke nukleus untuk mengatur ekspresi gen terkait siklus sel. Promotor gen ini terikat oleh SOG1 atau faktor transkripsi lainnya. Regulasi progresi siklus sel dan endoreplikasi, yang pada akhirnya mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan tanaman.

SUMMARY Koordinasi genom plastid-nukleus sangat penting untuk aktivitas plastid, tetapi mekanismenya masih belum jelas. Dengan merawat/menumbuhkan tanaman Arabidopsis dengan ciprofloxacin, ditemukan bahwa ketidakstabilan genom plastid dapat mengubah endoreplikasi dan siklus sel. Hasil serupa diamati pada ketidakstabilan genom plastid dari mutan reca1why1why3. Pembelahan sel dan perkembangan embrio terganggu pada mutan reca1why1why3. Khususnya, gen SMR5 dan SMR7, yang mengkode penghambat siklus sel kinase, diregulasi pada tanaman ketidakstabilan genom plastid, dan mutasi gen SMR7 dapat mengembalikan fenotipe endoreplikasi dan pertumbuhan tanaman reca1why1why3. Lebih lanjut, ditetapkan bahwa faktor transkripsi respons kerusakan DNA SOG1 memediasi perubahan endoreplikasi dan siklus sel yang dipicu oleh ketidakstabilan genom plastid. Akhirnya, penelitian ini menunjukkan bahwa Reactive Oxygen Species (ROS) yang diproduksi dalam plastida penting untuk koordinasi genom plastid Nukleus. Temuan ini mengungkap mekanisme molekuler untuk koordinasi genom plastid dan nukleus selama pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Koordinasi genom plastid-nukleus sangat penting untuk aktivitas plastid, tetapi mekanismenya masih belum jelas. Dengan merawat/menumbuhkan tanaman Arabidopsis dengan ciprofloxacin, ditemukan bahwa ketidakstabilan genom plastid dapat mengubah endoreplikasi dan siklus sel. Hasil serupa diamati pada ketidakstabilan genom plastid dari mutan reca1why1why3. Pembelahan sel dan perkembangan embrio terganggu pada mutan reca1why1why3. Khususnya, gen SMR5 dan SMR7, yang mengkode penghambat siklus sel kinase, diregulasi pada tanaman ketidakstabilan genom plastid, dan mutasi gen SMR7 dapat mengembalikan fenotipe endoreplikasi dan pertumbuhan tanaman reca1why1why3. Lebih lanjut, ditetapkan bahwa faktor transkripsi respons kerusakan DNA SOG1 memediasi perubahan endoreplikasi dan siklus sel yang dipicu oleh ketidakstabilan genom plastid. Akhirnya, penelitian ini menunjukkan bahwa Reactive Oxygen Species (ROS) yang diproduksi dalam plastida penting untuk koordinasi genom plastid Nukleus. Temuan ini mengungkap mekanisme molekuler untuk koordinasi genom plastid dan nukleus selama pertumbuhan dan perkembangan tanaman.

TERIMA KASIH