Pengaruh Pemberian EKSTRAK ETANOL BIJI Kakao (Theobroma cacao L Pengaruh Pemberian EKSTRAK ETANOL BIJI Kakao (Theobroma cacao L.) terhadap Jumlah SEL OsteoKlas Tulang TIBIA Tikus Putih (Rattus norvegicus) Pasca ovariektomi Dr. Putra Suryana, Sp.PD. Penguji I Dr. Onggung Napitupulu, M.Kes. Pembimbing I Dr. Endang Asmaningsih, M.S. Pembimbing II Stefanus Gunawan 0910714054

Latar Belakang Definisi: penyakit degenerasi tulang yang, ditandai dari massa tulang yang kecil dan deteriorasi mikroarsitektural dari jaringan tulang yang menyebabkan kerapuhan dan kerentanan terhadap fraktur, terutama pada pinggul, tulang belakang, dan pergelangan tangan (Shen, 2009)

Populasi Terjangkit di Amerika Serikat Prevalensi Osteoporosis Populasi Terjangkit di Amerika Serikat 52 juta penderita baik wanita dan pria 2010 Perkiraan 61 juta penderita baik wanita dan pria Akan Tetap Bertambah 2020

Wanita 4x lebih beresiko dibandingkan pria Penelitian mengenai osteoporosis pada perbedaan gender Penurunan tingkat estrogen setelah menopause Tulang yang lebih ringan dan tipis Wanita 4x lebih beresiko dibandingkan pria

Pencegahan Penyakit Jantung dan Kanker Pandangan Polifenol Terdahulu Sekarang Pencegahan Penyakit Jantung dan Kanker Pencegahan Penyakit Osteoporosis

3 Jenis Proantosianin Kandungan Polifenol Antosianin KAKAO Catechin Dalam kebanyakan kasus, mayoritas aktivitas antioksidan mungkin berasal dari senyawa flavonoid, isoflavon, flavon, antosianin dan catechin dibandingkan dari Vitamin C, E dan β-karoten (Kahkonen et al., 1999, dalam Osman, 2003)

Rumusan Masalah Apakah pemberian ekstrak kakao berpengaruh pada jumlah sel osteoklas pada tikus paska ovariektomi Rumusan Masalah Berapakah jumlah sel osteoklas tulang tibia tikus putih paska ovariektomi akibat pemberian ekstrak biji kakao

Tujuan penelitian Tujuan Umum Tujuan Khusus Membuktikan bahwa pemberian ekstrak biji Kakao (Theobroma cacao L.) berpengaruh dan dapat menurunkan jumlah osteoklas tulang tibia pada tikus Wistar paska ovariektomi sebanding dengan jumlah dosis yang diberikan. Tujuan Umum Mengetahui jumlah sel osteoklas sebelum ovariektomi. Mengetahui jumlah sel osteoklas tulang tibia pada pemberian ekstrak biji kakao paska ovariektomi. Mengetahui jumlah sel osteoklas tulang tibia dengan pemberian dosis ekstrak biji kakao yang berbeda paska ovariektomi. Mengetahui dosis optimum ekstrak biji kakao yang digunakan untuk menurunkan jumlah sel osteoklas tulang tibia paska ovariektomi. Tujuan Khusus

Manfaat penelitian Akademis Praktis Menambah wawasan tentang kakao Mengetahui potensi ekstrak biji kakao dalam pencegahan terjadinya osteoporosis melalui mekanisme pengontrolan sel osteoklas. Dapat dijadikan sebagai dasar teori untuk menambah khasanah ilmu pengetahuan dalam bidang kesehatan, khususnya tentang kegunaan ekstrak biji kakao sebagai diet pencegahan osteoporosis berbasis bahan alam asal Indonesia Praktis Menambah pengetahuan masyarakat bahwa ekstrak biji kakao dapat digunakan bahan alam yang dapat digunakan sebagai obat alternative dan bahan makanan dalam pencegahan osteoporosis sebagai bahan pertimbangan industry tanaman kakao untuk meningkatkan ragam produksi coklat kaya akan polifenol sebagai hidangan yang menyehatkan

Kerangka Konsep Menopause ↓ Estrogen Ekstrak Kakao ↑ Sytokines (M-CSF, NF-κB, IL-6 dll) ↓ Sytokines (M-CSF, NF-κB, IL-6 dll) ↑ Stress oksidatif (ROS) ↓ Stress oksidatif (ROS) ↑ Apoptosis osteoblas ↓ Jumlah sel osteoklas ↑ Jumlah sel osteoklas Osteoporosis

Kakao Tulang Osteoklas Flavonoid Sitokin Antioksidan ROS Sitokin dalam mediator inflamasi berperan penting dalam penurunan fibroblas dan kolagen juga pengingkatan diferensiasi fungsi dan kelangsungan hidup osteoklas Peningkatan stres oksidatif memicu peningkatan diferensiasi dan fungsi sel osteoklas. Akibat peranan ROS langsung dihasilkan superoksida yang bersifat mendegradasi tulang Kakao Tulang ROS Sitokin Osteoklas Antioksidan Flavonoid

Hipotesis Ekstrak biji kakao (Theobromin cocoa l.) dapat mengurangi jumlah sel osteoklas tulang tibia tikus putih (Rattus norvegicus) paska ovariektomi

Metode Penelitian Rancangan Penelitian Design true experimental in vivo dengan Randomized Post test Only Controlled Group Design

Skema desain penelitian Hewan coba: 25 tikus putih (Rattus norvegicus) Randomisasi K (-) 5 Ekor P1 K (+) P2 P3 OT Ekstrak1 Ekstrak2 Ekstrak3 Histopatologi

Keterangan : OT=Ovariektomi Ekstrak = Ekstrak biji kakao K (-)=kontrol negatif : tikus tanpa perlakuan ovariektomi dan tanpa pemberian ekstrak, diamati setelah 8 minggu K (+)=kontrol positif : tikus dengan perlakuan ovariektomi saja dan tanpa pemberian ekstrak, diamati setelah 8 minggu P1=perlakuan 1 : tikus dengan perlakuan ovariektomi 4 minggu dan pemberian ekstrak kakao 4 minggu dengan dosis 125 mg/kgBB tikus, kemudian diamati P2=perlakuan 2 : tikus dengan perlakuan ovariektomi 4 minggu dan pemberian ekstrak kakao 4 minggu dengan dosis 250 mg/kgBB tikus, kemudian diamati P3=perlakuan 3 : tikus dengan perlakuan ovariektomi 4 minggu dan pemberian ekstrak kakao 4 minggu dengan dosis 500 mg/kgBB tikus, kemudian diamati

Variabel Penelitian Variabel Bebas Variabel Tergantung Ekstrak kakao dengan berbagai dosis P1 125 mg/kgBB P2 250 mg/kgBB P3 500 mg/kgBB Variabel Tergantung Jumlah osteklas pada tulang tibia

Prosedur Penelitian Persiapan Hewan Coba Ovariektomi Hewan Coba Pembuatan Ekstrak Kakao Pemberian Ekstrak Kakao Pengambilan Tulang Tibia Tikus Dekalsifikasi Tulang Pemrosesan Jaringan Osteon Pewarnaan HE Pengumpulan & Analisis Data

Definisi operasional Kakao yang digunakan adalah buah kakao dari pohon varietas mulia/edel. Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih strain wistar (Rattus norvegicus strain wistar) betina. Tikus dibagi menjadi 5 kelompok (n=5) yaitu 1 kelompok kontrol negatif, 1 kelompok kontrol positif dan 3 kelompok perlakuan (P1, P2, P3). Pemberian ekstrak dilakukan secara per oral (p.o) selama 4 minggu pada kelompok perlakuan (P1, P2, P3) masing- masing dengan dosis 125 mg/kgBB tikus, 250 mg/kgBB tikus dan 500 mg/kgBB tikus. Sel osteoklas pada preparat histologi dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin dengan pemeriksaan osteoklas berupa sel raksasa multinukleus pada sisi tulanng resorbsi, setoplasma seperti busa dan sedikit asidofilik

Kontrol negatif

Kontrol posistif

Perlakuan 1

Perlakuan 2

Perlakuan 3

Prosedur Pengumpulan dan Analisis Data Pengumpulan Data Data dikumpulkan dari hasil evaluasi pada kelompok tikus kontrol negatif, positif, perlakuan I, II dan III. Setelah minggu ke- 8 dilakukan evaluasi hasil dari pengukuran jumlah osteoklas secara histopatologi kemudian mencatat hasil dari evaluasi yang telah dilakukan.   Analisis Data Analisa data statistik menggunakan SPSS Ver 20.0. Dilakukan uji homogenity of varience, One way ANOVA digunakan untuk mengetahui apakah ada efek bermakna dari perlakuan yang dilakukan pada rata-rata dua atau lebih kelompok. Regresi korelasi pearson digunakan untuk mengatahui dose effect relationship.

Jumlah sel osteoklas Kelompok Tikus Rerata Standar Deviasi 1 2 3 4 5 (SD) K(-) 1.25 0.75 0.5 0.9 0.25495 K(+) 2.75 3.75 5.25 3.25 3.55 0.92736 P 1 1.5 1.75 1.45 0.18708 P 2 1.15 P 3 0.25 0.6 0.37417

Diagram sel ostoklas

Analisis data Uji normalitas data: (p>0,05). Uji homogenitas varian (p=0,341), Uji One-way ANOVA (p=0.000) Post Hoc test (uji Tuckey HSD) (p <0,05). Correlation and regression test

pembahasan Hilangnya esterogen akan menginduksi osteoclastogenesis. Kandungan antioksidan dalam ekstrak etanol biji kakao dapat menekan sitokin inflamasi dan stres oksidatif. Dosis 250 mg/ml/hari menunjukkan hasil yang mendekati gambaran tulang normal.

Pembahasan 1 hilangnya hormon steroid setelah ovariektomi menyebabkan tingginya resorbsi tulang dibanding tulang yang terbentuk (osteoclastogenesis). Wanita yang telah mengalami menopause juga menunjukkan peningkatan konsentrasi IL-1 sampai IL-6, dimana IL-1, IL-6 dan TNF-α berperan meningkatkan kerja osteoklas. Estrogen juga mengurangi stress oksidatif yang memicu meningkatnya apoptosis dari osteosit dan osteoblas Esterogen mampu mempengaruhi gen-gen yang ada pada osteoklas dan jalur lain diluar osteoklas yang berguna untuk menjaga keutuhan struktur dan fungsi dari tulang

Pembahasan 1 Hasil penelitian untuk kelompok tikus 8 minggu pasca ovariektomi didapatkan jumlah sel osteoklas meningkat secara signifikan jika dibandingkan dengan kelompok tanpa ovariektomi (kelompok kontrol negatif). Pada tikus kelompok normal yang tidak diberi perlakuan ovariektomi seperti kelompok lainnya, terdapat kadar esterogen yang cukup untuk mengatur aktivitas osteoklas.

Pembahasan 2 Polifenol diketahui tidak hanya berperan dalam pencegahan penyakit jantung dan kanker, tetapi juga pencegahan osteoporosis karena potensi karakter antioksidan dan antiinflamasi. Flavanoid (procyanidins) dalam kakao juga diketahui dapat mengatur keterlibatan sitokin dalam respon inflamasi . Selain itu Polifenol golongan Katekin juga menghambat produksi dari sitokin pro-inflamasi.

Pembahasan 3 Ada perbedaan yang signifikan antara dosis 125mg/kgBB, dan 500mg/kgBB dapat disebabkan kemungkinan dosis yang diberikan berada dalam rentang jangkauan yang panjang, sehingga penurunan jumlah sel osteoklas antara dosis I dan III terlihat signifikan secara statistik. Arah korelasi adalah negatif, yang berati semakin besar dosis ekstrak biji kakao, maka semakin kecil jumlah sel osteoklas. Pada pemberian ekstrak biji kakao 250mg/kgBB didapatkan bahwa ekstrak biji kakao sudah berdampak dalam menurunkan jumlah osteoklas dan sudah mendekati jumlah osteoklas tikus kelompok normal

kesimpulan Terdapat peningkatan jumlah sel osteoklas tulang tibia pada tikus wistar (Rattus norvegicus) pasca ovariektomi. Terdapat penurunan jumlah sel osteoklas tulang tibia pada tikus wistar (Rattus norvegicus) pasca ovariektomi setelah pemberian ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L). Arah korelasi antara dosis ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L) dengan jumlah sel osteoklas tulang tibia tikus wistar (Rattus novergicus) adalah negatif, yang berarti semakin besar dosis ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L) yang diberikan, maka semakin kecil jumlah sel osteoklas tulang tibia yang ditemukan. Dosis ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L) optimum yang dapat menurunkan jumlah sel osteoklas tulang tibia tikus wistar (Rattus norvegicus) pasca ovariektomi adalah pada pemberian ekstrak biji kakao dosis 250mg/kgBB.

saran Pengaplikasian ekstrak biji kakao (Theobroma cacao L) dalam pencegahan osteoporosis. Penggunaan EDTA untuk dekalsifikasi jaringan lebih disarankan khususnya pada tulang tibia (slow decalcification metod) agar penampakan sel secara mikroskopis lebih jelas terlihat. Perlu dilakukan pemfraksian bahan aktif dalam biji kakao sehingga penggunaan dosis tidak terlalu besar.

Drink for healthy bone TERIMA KASIH

Tests of Normality   Perlakuan Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk Statistic df Sig. Osteklas K Negatif .237 5 .200* .961 .814 K Positif .224 .842 .171 P1 (125 mg/kg BB) .252 .867 .256 P2 (250 mg/kg BB) P3 (500 mg/kg BB) .201 .881 .314 *. This is a lower bound of the true significance. a. Lilliefors Significance Correction

Test of Homogeneity of Variances Osteklas Levene Statistic df1 df2 Sig. 1.200 4 20 .341 ANOVA Osteklas   Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 37.095 4 9.274 68.190 .000 Within Groups 2.720 20 .136 Total 39.815 24

Homogenous Subsets Tukey HSD Kode N Subset for alpha = 0.05 1 2 3 P3 (500 mg/kg BB) 5 .6000   Kontrol Neg .9000 P2 (250 mg/kg BB) 1.1500 P1 (125 mg/kg BB) 1.4700 Kontrol Pos 3.9900 Sig. .168 .144 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.000.

Correlations   Osteoklas Dosis Pearson Correlation 1 -.871** Sig. (2-tailed) .000 N 20 **. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

  K (-) K (+) P 1 P 2 P 3 - 0,000* 0,144 0,819 0,702 0,000 0, 144 0,651 0,010 0, 819 0,168 0, 702

Osteoklas adalah sel multinukleus yang berperan dalam proses resorpsi tulang. Ketidakseimbangan antara pembentukan tulang dan resorpsi tulang adalah kunci dari patofisiologi dari penyakit metabolic penyakit tulang pada orang dewasa termasuk osteoporosis (Fazzalari, 2008 dalam Shen et al 2009). Osteoklas merupakan sebuah sel raksaasa yang mempunyai ciri memiliki banyak nukleus (multiple nuclei) dan sebuah sitoplasma yang homogen dengan tampilan seperti busa (foamy). Gambaran ini dikarenakan adanya konsentrasi yang tinggi dari vesikel dan vakuola. Pada beberapa tempat aktif resorbsi tulang, osteoklas membentuk membran sel khusus (ruffled border) yang bersentuhan