Replikasi DNA Drs. Sutarno, MSc., PhD.

Replikasi DNA

Replikasi DNA Replikasi DNA dimulai dengan membukanya DNA double helix pada suatu daerah yang disebut replication fork. Membukanya double helix ini disempurnakan oleh kerja enzim DNA helicase. Daerah membukanya double helix DNA ini, terlihat dengan mikroskop electron seperti gelembung (bubble), dan dengan demikan disebut sebagai suatu replication bubble. Bubble ini akan mengalami peningkatan ukurannya sejalan dengan bergeraknya replication fork pada DNA helix dalam dua arah

Sejalan dengan terpisahnya dua untai DNA ("unzip") dan Basa-basa nitrogennya terdedah, enzim DNA polymerase Bergerak ke posisi pada titik tempat sisntesis akan dimulai.

Enzim-enzim dalam replikasi DNA 1.Topoisomerase: bertanggung jawab dalam proses dimulainya pembukaan double heliks DNA. Tegangan ikat pada struktur gulungan double heliks DNA dapat dipatahkan dengan penorehan (nicking) salah satu untai DNA tunggal (topoisomerase I). Topisomerase II menoreh untai DNA dua-duanya. Topoisomerases I dan II tetap berikatan dengan DNA setelah nicking. 2.Helicase; menyempurnakan proses membukanya double heliks, setelah gulungan supercoil dihilangkan oleh topoisomerase. Dua untai DNA ini secara alami ingin berikatan satu sama lain karena adanya afinitas ikatan hidrogen, dengan demikian, aktivitas helikase memerlukan energi dalam bentuk ATP untuk memisahkan menjadi dua untai DNA.

 3.DNA polymerase: mengkatalisis pembentukan ikatan hidrogen antara nukleotida baru yang akan membentuk untai baru dengan nukleotida pada untai DNA lama yang berfungsi sebagai pencetak (template strand). mengkatalisis reaksi antara 5' phosphate pada nukleotida baru dan 3' OH bebas pada polinukleotida yang sedang dibentuk (ikatan phosphodiester). Sebagai hasilnya, untai baru DNA hanya dapat bertambah panjang pada arah dari 5' ke 3‘. Sekali lagi, untuk diketahui bahwa ikatan phosphodiester dibentuk antara gugus 3' OH pada gula dengan gugus 5' phosphate dari nukleotida yang baru. Terdapat beberapa bentuk polymerase DNA; DNA polymerase III bertanggungjawab dalam proses sintesis untai DNA baru. DNA polymerase adalah kelompok yang terdiri dari beberapa sub-unit protein yang berbeda (disebut holoenzyme). Enzim ini memiliki aktivitas proofreading, yaitu dapat memastikan bahwa enzim ini menyisipkan basa nitrogen yang tepat, dan memiliki aktivitas sebagai 3'à 5' exonuclease (excision of nucleotides) dengan demikian enzim ini dapat memotong bila terjadi kesalahan.

Arah replikasi Untai DNA baru, selalu disintesis dalam arah 5' ke 3'. 5' triphosphate hanya dapat ditambahkan ke gugus 3'OH dari deoxyribose.

4. Primase, adalah bagian dari agregat protein yang disebut primeosome  4.Primase, adalah bagian dari agregat protein yang disebut primeosome. Enzim ini berfungsi menempelkan primer RNA pendek ke untai tunggal/ single-stranded DNA untuk bertindak sebagai pengganti 3'OH bagi DNA polymerase sebagai tempat darimana memulai sintesis. Primer RNA ini pada akhirnya akan dibuang oleh RNase, dan gap/ tempat lowong ini akan diisi oleh kerja DNA polymerase I. 5.Ligase: mengkatalisis pembentukan ikatan phosphodiester antara 3'OH dan 5'phosphate yang berdekatan. Enzim ini dapat menyambung gap yang tidak tersambungketika RNA primer dibuang dan kemudian digantikan. 6.Single-stranded binding proteins: sangat penting untuk menjaga stabilitas dari replication fork. Single-stranded DNA adalah sangat labil, atau tidak stabil, oleh karena itu protein ini akan berikatan dengannya ketika masih dalam keadaan untai tunggal (single stranded) dan menjaganya agar tdk terdegradasi.

Enzym2 yang terlibat dalam replikasi

Dimana dan bagaimana enzim DNA polymerase memulai sintesis? Titik mulai (start point) bagi enzim DNA polymerase adalah pada segmen pendek yang dikenal sebagai RNA primer. Secara termnologi, "primer" menunjukkan perannya untuk memulai (to "prime“) sintesis DNA pada suatu titik tertentu. Primer ini terletak secara komplemen terhadap DNA template oleh enzim yang dikenal dengan RNA polymerase atau Primase. DNA polymerase, kemudian menambahkan nukleotida satu persatu dalam urutan yang betul-betul komplemen, yaitu A--T dan G--C.

Bagaimana DNA polymerase mengetahui basa mana yg harus ditambahkan? DNA polymerase digambarkan sebagai "template dependent" (tergantung pada template/ cetakannya) sehingga enzim ini akan “membaca” sekuen basa nitrogen pada template DNA, dan kemudian mensintesis untai komplemennya. Untai DNA template selalu dibaca dari arah 3' ke 5' (yaitu dimulai dari ujung 3’ DNA template dan membaca nukleotida-nukleotida secara urut ke arah ujung 5’ dari DNA template). Untai DNA yang baru dibentuk (karena komplemen dengan DNA template) maka pasti disintesis pada arah 5’ ke 3’. (ingat bahwa 2 untai DNA berpasangan secara antiparallel).

Studi-studi yang dilakukan pada genom organisme prokaryotic menunjukkan bahwa DNA memiliki dua fungsi utama dalam replikasi dirinya sendiri: Pertama, berfungsi sebagai template (cetakan), dan Kedua, menghasilkan enzim, khususnya DNA polimerase, dan protein-protein lain yang membantu proses replikasi. Replikasi DNA dapat dimulai pada beberapa situs (multiple sites) disepanjang DNA template, dan masing-masing potongan yang dihasilkan di gabungkan bersama oleh enzim DNA ligase. Replikasi DNA sirkuler dimulai pada titik khusus dalam lingkar DNA yang mengarahkan terbentknya replication bubble Replikasi untuk molekul DNA linier dimulai pada titik spesifik melalui pembentukan replication bubble. “original of replication” atau titik awal replikasi (titik Ori) merupakan titik khusus untuk dimulainya repikasi.

THE TWO STRANDS OF DNA ARE ANTIPARALLEL

Ikatan Phospho diester

Replikasi Discontinue DNA selalu direplikasi dari ujung 5' ke ujung 3‘. Karena dua untai DNA adalah antiparalel, ini berarti ada satu untai sebagai "leading strand", yang dapat melakukan replikasi secara kontinu, dan terdapat untai satunya sebagai "lagging strand" yang terdiri dari fragmen-fragmen pendek yang kemudian harus disambung menjadi satu untaian (oleh enzim DNA Ligase).

Fragmen Okazaki Karena untai DNA asli (template) terdiri dari dua untai tunggal yang komplemen dan antiparalel, maka hanya satu untai DNA baru yang dapat mulai pada ujung 3' dari DNA template dan dapat bertambah panjang (tumbuh) secara kontinue ketika titik replikasi (the replication fork) bergerak di sepanjang DNA template. Untai DNA yang lain harus tumbuh pada arah yang berlawanan, dan hasil dari replikasi secara diskontinue ini adalah berupa urutan fragmen-fragmen pendek DNA baru yang disebut fragmen Okazaki. Untuk menjadikan segmen-segmen pendek DNA baru ini dibuat dalam untai yang kontinue, segmen-segmen ini digabungkan oleh kerja enzim DNA ligase yang “merekatkan” potongan-potongan ini menjadi satu untaian dengan pembentukan ikatan phosphodiester

Tahap terakhir adalah membuang RNA primer oleh kerja enzim, dan kemudian mengisi kekosongan ini dengan deoksinukleotida sehingga menjadi untai DNA yang utuh.

The replication fork

Okazaki Fragments

Replikasi semi-konservatif Karena masing-masing untai DNA baru adalah komplemen terhadap untai templatenya, maka kopi DNA baru yang identik dengan template double heliks dihasilkan selama replikasi. Pada masing-masing heliks baru, satu untai adalah template DNA lama, dan untai lainnya adalah untai DNA baru yang baru saja disintesis, inilah yang disebut dengan replikasi secara semi-conservative. Dengan demikian dihasilkan dua kopi DNA yang identik.

Semiconservative vs conservative model

DNA is replicated "semi-conservatively"

DNA Replication

Proses replikasi DNA pada semua organisme adalah proses yang sangat menakjubkan. Total jumlah gen pada sel manusia, genom manusia, diperkirakan sekitar 3 milyar pasang basa (base pairs), dan pada satu untai tunggal berisi mencapai 250 juta pasang basa. Yang lebih menakjubkan lagi, kecilnya kesalahan yang terjadi meskipun ukuran DNA manusia yang begitu besar. Kesalahan hanya terjadi sekitar satu dalam setiap 10-100 milyard DNA. Proses replikasi DNA secara sempurna pada sel-sel manusia berlangsung beberapa jam. Untuk mereplikasi DNA yang sebesar ini dalam waktu yang hanya beberapa jam, memerlukan tidak hanya satu replication fork, membentuk beberapa replication bubble dan mengahasilkan beberapa segmen untai DNA yang pada akhirnya disambung-sambung membentuk DNA double heliks baru.

Perbaikan DNA Dalam kaitannya dengan terjadinya kesalahan, makhluk hidup memiliki mekanisme DNA proofreading dan perbaikan yang dapat mengenali terjadinya kesalahan pasangan-basa dan kerusakan DNA dan memperbaikinya. Terdapat dua jalur perbaikan: base excision, memperbaiki basa yang tertukar dengan cara membuangnya oleh kerja DNA glycosylase yang diikuti dengan membuang gula fosfat yang terbentuk. nucleotide excision, nukleotida disekitar daerah yang rusak dibuang sebagai oligonucleotida. Kekosongan yang terjadi dari dua proses tersebut kemudian diisi oleh kerja secara berurutan dari DNA polymerase dan DNA ligase.

Quis 1 Sebutkan dan jelaskan komponen-komponen penyusun DNA, dan Jelaskan serta gambarkan bagaimana struktur DNA Jelaskan apa yang dimaksud dengan ikatan phosphodiester dan ikatan hidrogen dalam struktur DNA

Q2 Jelaskan apa yang dimaksud dengan replikasi, enzim apa saja yang terlibat dalam prosesi ini berikut fungsi masing-masing enzim Jelaskan apa yang dimaksud dengan replikasi diskontinue, mengapa terjadi proses ini dan bagaimana mekanismenya hungga terbentuknya untai DNA yang baru Jelaskan apa yang dimasksud dengan: Fragmen Okazaki Replikasi semikonservatif Leading strand Base excision

References 1.Alberts B. Johnson A, Lewis J., Raff M., Robert K, Walter P. 2002. Molecular Biology of Cell. 4th Ed. Garland Science. 2. Stansfield, W.D., Cano,R.J, Colome,J.S. 2006. Moleculer and cell Biology. McGraw Hill companies. 3.Freifelder,D. 2002. Essentials of Molecular Biology. J ones and Bartlett publishers, Boston 4. Lodish H., Berk A., Matsudaira P., Kaiser CA., Krieger M., Scott MT. Zipursky SL., Darnell J. 2004. Molecular Cell Biology. 5th Ed.  5. Beberapa sumber gambar dari internet untuk Biomol.