Analisis secara enzymatis JURUSAN FARMASI FKIK UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN Analisis secara enzymatis Oleh : Hendri Wasito, S. Farm., Apt.

Tinjauan umum Pemanfaatan reaksi enzimatis dapat digunakan untuk anaisis obat pada sampel biologis dengan mengamati jumlah produk yang dihasilkan atau jumlah koenzim yang digunakan. Dengan reaksi enzymatis tidak dibutuhkan tekik yang rumit dan proses pre-treatment yang panjang. Contoh : analisis antibiotik aminoglikosida (gentamisisn da kanamisin) dengan enzym asetil/adenil transferase yang dilabel.

Apa itu enzim ??? Enzim merupakan senyawa organik bermolekul besar yang berfungsi untuk mempercepat jalannya reaksi metabolisme di dalam tubuh tumbuhan tanpa mempengaruhi keseimbangan reaksi Enzim tidak ikut bereaksi, struktur enzim tidak berubah baik sebelum dan sesudah reaksi tetap Enzim merupakan biokatalisator Bagian enzim yang aktif adalah sisi aktif dari enzim, tempat berikatannya dengan substrat pada saat reaksi katalitik

Enzim diberi nama sesuai dengan nama substrat dan reaksi yang dikatalisis Biasanya ditambah akhiran ase Enzim dibagi ke dalam 7 golongan besar Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) Fosfotransferase ATP : glukosa = hesokinase = EC 2.7.1.1 = transferase. Fosfotransferase. Fosfotransferase dengan gugus hidroksil sebagai penerima. D-glukosa sebagai penerima gugus fosfat) Tata nama enzim

S + E (ES) (EP) E + P Diffusion & Affinity Catalysis Product release

Enzym Multiplied Immunoassay Technique (EMIT) Prinsip kerja : Setiap mol obat stoikiometris dengan setiap mol enzim yang dilepaskan. Setiap mol enzim bereaksi dengan substrat yang ada dan akan menghasilkan produk. Yang diukur adalah jumlah produk yang dihasilkan. SUBSTRAT URIN / PLASMA ANTIBODI SPEKTRO ENZIM-OBAT KONJUGAT

Mekanisme kerja EMIT Kompleks antara enzim-obat-antibody merupakan kompleks yang inaktif, sehingga substrat tida dapat masuk ke sisi aktif anzim. Adanya obat bebas akan menyebabkan terjadinya kompetisi antara obat yang sudah terikat dengan obat bebas untuk berikatan dengan antibodi. Obat bebas akan berikatan dengan antibodi akan menyebabkan enzim terlepas dari komples sehingga sisi aktif enzim bebas dan substrat tidak dapat masuk. Kemudian akan terjadi reaksi enzimatis dan akan menghasilkan suatu produk.

Contoh EMIT Substar : Glukosa-6-Phosphat Enzim : Dehidrogenase G6P Koenzim : NAD (Nicotinamid Adenin Diphosphat) Reaksi : substrat + enzim  keilangan atom H NAD + H  NADH Pengamatan : λ 340-345 nm (NAD tidak memberkan absorbansi, NADH mengabsorbansi)

Kelebihan dan Kekurangan EMIT Reaksi cepat Mudah diautomatisasi Tidak perlu dilabel radioaktif Kekurangan Semikuantitatif Ketersediaan antibodi dan konjugat enzim sukar didapat

Radio Immuno Assay (RIA) Analisis berdasarkan reaksi antigen-antibody (berlabel radioaktif) Selektifitasnya tinggi (antigen-antibody) dan sensifitasnya tinggi (10-100 x spektro UV) Awalnya digunakan untuk senyawa peptida dan hormon yang sulit dideteksi dengan UV. Perkembangannnya dapat untuk analisis senyawa obat. Radioisotop yang biasa digunakan : H-3, C-13, S-35, P-32, I-125, Co-60. (sebaiknya dipilih yang t1/2 panjang dan partikel yang dihasilkan lebih aman)

Contoh analisis RIA Digoksin tak-berlabel (sampel) ditambahkan digoksin terlabel dengan jumlah diketahui ditambahkan antibodi yang akan direaksikan antigen. Antigen akan sebanding dengan obat (digoksin). Setelah 20 menit diinkubasi, komponen yang terikat antibodi dan yang tak terikat dipisahkan dengan arang aktif, digoksin bebas akan terserap dan digoksin-antibodi terlarut. Hasil dibaca radioaktivitasnya. Bandingkan dengan standar yang sudah diketahui kadarnya. Semakin besar kadar digoksin semakin kecil digoksin terlabel yang terikat antibodi (berbanding terbalik)

Substrat Labeled Fluorescent Immunoassay (SLFI) FDR (Fluorogenic Drug Reagent) misalnya Umbeliferon galaktosida. FDR jika dihidrolisis oleh enzim tertentu maka florogeniknya akan terlepas sehingga akan dapat berfluoresensi. FDR + AB + D B-galaktosidase Hidrolisis FLUORESENSI AB-FDR + AB-D

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), ELISA also known as an enzyme immunoassay (EIA), is a biocheical technique used mainly in imunology to detect the presence of an antiody or an antigen in a sample. ELISA test kits can use for research and detection of drugs and/or their metabolites. ELISA is a widely-used method for measuring the concentration of a particular molecule (e.g., a hormone or drug) in a fluid such as serum or urine.

Hatur nuhun pisan ... Jangan lupa untuk menambah informsi sumber bahan kuliah dari sumber lainnya ...

Daftar Presentasi Tugas Jurnal Terstruktur Akhir Ratnawati dkk. An LC-MS Method for The Deermnation of Cyclizin in Human Serum. Meliyana Perwita S. Dkk. Identifikasi Ofloxacin dalam Seru Dengan Metode HPLC. Winda Ariyani dkk. Speciation of Drugs in Blood Serum by Surfactant-Mediated HPLC/ICP-MS with Direct Sample Injection Afnan dan Gina Puspita S. Analysis of Drug and Metabolites in Blood and Urine Using Automated Disposable Pipette Extraction. Banu Aji Wijayanto dkk. High-Performane Liquid Chromatography Determination of Metrotrexate in Plasma. Sabrina Nur F. Dkk. Quantification of The Plant-Derivated Hallucinogen Salvinorin in Conventional and Non-Conventional Biological Fluids by Gas Chromatography/Mass Spectrometry After Salvia Diviningrum Smoking. Prima A. Dan Putri D. F. Analisis Aspirin pada Urin Relawan Wanita di Musim Dingin.