TRANFORMASI FRAGMEN DNA KROMOSOM Xanthomonas campestris KE DALAM Escherichia coli JURNAL SAINS, VOL. 6, NO. 1, APRIL 2002 Wibowo Mangunwardoyo

4/7/2017 3

4/7/2017 2

4/7/2017 1

Metoda dasar yang digunakan dalam bidang biologi molekular Pada dasarnya pada studi biomolekular ini berkaitan dengan analisis makro molekular. Beberapa metoda dasar dalam studi molekular A. Penggunaan radioisotop Isotop adalah elemen elemen kimia yang mempunyai jumlah proton yang sama dalam inti atom, namun memiiki no massa yang berbeda (proton dan neutron)‏ contohnya : - S35 digunakan untuk melabel protein atau melabel nukleotida yang digunakan dalam penentuan urutan basa DNA (DNA sequensing)‏ - [α-P32] UTP-RNA : digunakan dalam translasi dan transkripsi in vivo guna mempelajari promoter suatu gen yang mengatur proses transktripsi. - [α-S35]dATP atau [α-P32dATP juga untuk analisis urutan basa nukleotida sehingga dapat membaca autoradioaktivitas frgament fragment nukelotida panda gel elektroforesis.

Untuk mendeteksi berbagai jenis penyakit seperti : a. 24Na untuk mendeteksi adanya gangguan peredaran darah b. 50Fe untuk menetahui laku pembentukan sel darah merah c. 131I untuk mendeteksi getah tiroid dalam kelenjer gondok d. 60Co untuk terapi pengobatan kanker e. 201Ti untuk mendeteksi kerusakan jantung f. 32P untuk mendeteksi penyakit mata,tumor, hati,menghambat pembetukan sel darah merah yang berlebih g. 133Xe untuk mendeteksi penyakit paru paru h. 99Tc untuk mendeteksi tulang manusia Pada dasarnya ada 2 cara untuk mendeteksi radioaktifitas pada hasil suatu reaksi biokimia molekular yang dilakukan dengan menggunakan bahan radioaktif Yaitu : 1. Dengan prinsip autoradiografi : pada penetuan urutan basa DNA atau frgamen DNA. HAsilnya kemudian dielektroforesis pada gel poliakrilamide. Selembar film sunar X diletakan diatas gel poliakrilamide tersebut, sehingga radioaktifitas yang memancar dari gel akan mengenai lembar sinar X tersebut akan membentuk citra sesuai dengan pola urutan fragment polinikleotida

Morphology of Hela cells were stained by TUNEL assay view under LCSM Figure 5 : Confocal micrograph of LCSM . A control of HeLa cells, B shows condensation of nucleus, C shows membrane blebbing, D shows morphological starting of nucleus fragmentation, E shows nuclear fragmentation and F shows nuclear break-down dan form apoptotic body

Contoh : ekspresi dari onkogen c-myc pada sel kanker rahim setelah diobati 72 jam dengan ekstrak neem Figure 10. Efek dari xtract ethanol dari A.indica (neem) thd ekpresi gen c-myc pada sel kanker rahim (HeLa). . Note: s is standard, n is normal control (housekeeping genes), ut is untreated and t is treated

Apoptotic DNA laddering Figure 9 : DNA Ladder assayed with apoptoric DNA laddering kits. Line N DNA mix ladder. Line 1 Hela untreated, line 2 Hela treated cells by EtOh leaves extract of A. indica

(DNA) Truktur DNA dianalisa oleh James Watson & Francis Crick in 1953 DNA adalah sebuah polimer pembangun unit nya terdiri dari pospat, deoxyribosa dan basa nitrogen are attached. Two strands form a double helix (DNA) DNA Sugar Bases Phospate Nucleotide In 1953 James Watson and Francis Crick described the structure of DNA. For this analysis they awarded the Nobel price. The DNA consists out of nucleotides, a nitrogenous base attached to a pentose sugar and phosphates backbone. The structure of a DNA looks like a simple ladder, which is wound up.

DNA and Base Complementarity Cytosine (C) Adenine (A) Guanine (G) Guanine (G) Thymine (T) Thymine (T) Guanine (G) Adenine (A) The nitrogenous bases can form complementary pairs, thymine binding with adenine and cytosine with guanine. Hydrogen bonds form between the complementary bases binding them together. The triple bond between cytosine (C) and guanine (G) is stronger than the double bond between thymine (T) and adenine (A). These bonds hold together complementary strands of DNA forming double-stranded molecules. Cytosine (C) Adenine (A)

THIS IS SEKUEN TARGET PICTURE Aplikasi dan perkembangan molekuler 1. Mutasi buatan : yaitu mutasi yang ditujukan untuk merubah susunan gen, sehingga sifat yang diturunkan pun berubah. Mutasi buatan ini umumnya menggunakan radiasi, contohnya : padi variasi Atomita I dan II, kedelai variasi Muna. 2. Transplantasi gen / Penyisipan gen / Teknologi Plasmid: yaitu penyisipan gen organisme satu ke genom organisme lain, dengan tujuan untuk produksi suatu senyawa dalam skala besar dan cepat, untuk terapi medis, atau untuk mengatasi masalah lingkungan. 3. Hibridoma : yaitu teknik pencangkokan sel dengan materi genetik dari sel yang lain, yang umumnya digunakan untuk terapi medis kekebalan tubuh (imunoterapi) dan kanker. Contohnya pemasukkan genom penghasil antibodi dari sel limfosit, kedalam sel kanker yang sangat cepat berploriferasi, sehingga sel kanker tersebut dapat menghasilkan antibodi dan dapat melawan sel kanker lainnya atau zat asing yang masuk ke dalam tubuh dengan cepat, yang secara normal tidak bisa diatasi oleh antibodi dari sel limfosit saja. 4. Kloning : yaitu teknik perbanyakan sel, jaringan atau organisme secara aseksual, bias melibatkan dua induk atau satu induk. THIS IS SEKUEN TARGET PICTURE

Sekuen Target DNA/ RNA diperoleh dari hasil isolasi/ purifikasi target organisme Target Sequence DNA Strand Double Helix DNA Strand Supercoiled DNA Strand Chromosome

Abstrak Penelitian transformasi fragmen DNA Xanthomonas campestris ke dalam Escherichia coli DH5αα, digunakan vektor plasmid Escherichia coli (pUC19). DNA kromosom diisolasi dengan metoda CTAB. DNA plasmid diisolasi dengan metoda alkali lisis. Kedua sumber DNA dipotong menggunakan enzim restriksi EcoRI. Sel kompeten disiapkan dengan CaCl2, transformasi menggunakan metoda kejutan panas. Hasil transformasi didapatkan sebanyak 5 koloni putih (yang mengandung fragmen DNA), dengan frekuensi transformasi sebesar 1,22 x 10-8 koloni putih/sel kompeten. Elektoforesis agarosa menunjukkan variasi ukuran DNA fragmen sebesar 0,5 – 7,5 kb. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan dengan pembuatan pustaka genom untuk mendapatkan hasil transformasi yang lebih banyak.

Enzim protease berfungsi sebagai biokatalisator reaksi, mempunyai peranan yang penting dalam industri, obatobatan dan makanan. Penggunaan yang sangat luas ini karena sifatnya yang sangat spesifik, mampu aktif dalam konsentrasi rendah, selektif, aktif pada pH dan suhu yang sempit. Kebutuhan akan enzim yang selalu meningkat di Indonesia, memacu untuk mendapatkan mikroorganisme yang potensial dari bumi pertiwi. Xanthomonas campestris merupakan bakteri gram negatif umumnya bersifat patogen pada tanaman kedelai. Bakteri ini juga mampu menghasilkan enzim protease yang tinggi. Pendekatan molekular, merupakan salah satu usaha yang tepat untuk peningkatan produksi enzim protease. Ketergantungan Indonesia akan enzim protease terlihat adanya import yang setiap tahun selalu bertambah. Kekayaan biodiversitas di Indonesia yang selama ini hanya dimanfaatkan oleh peneliti asing, menjanjikan mikroorganisme yang mampu menghasilkan enzim protese dalam jumlah yang besar karena mikroorganisme merupakan pabrik dari segala enzim. Penelitian pendahuluan menunjukkan Xanthomonas campestris mampu menghasilkan enzim protase. Secara molekular dapat dipindahkan gen protease dari bakteri tersebut ke dalam Escherichia coli, jika didapatkan inang yang cocok, maka enzim protease akan dihasilkan dalam jumlah banyak.

TERIMA KASIH