Penentuan Nilai TPC Bacteria dengan Pour Plate Methods ( Metode Tuang) Sudrajat FMIPA UNMUL SAMARINDA TAHUN 2010 Bahan Diskusi pelatihan Pegawai BPOM Samarinda, Tahun 2010

Metode ini bertujuan menghitung nilai Total Plate Count Bacteria /TPC ( Angka Lempeng Total/ALT) suatu bahan Prinsif : pertumbuhan bakteri pada media setelah diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 2 x 24 jam Nilai TPC ditentukan dengan cara menanam tiap contoh : a. 1 ml contoh bahan dan b. 1 ml contoh bahan dengan penipisan 1 : 101 , 10 2 dan 1 : 103 masing- masing pada lempeng nutrient secara pour plate . Hasil pertumbuhan koloni dihitung dengan quibec coloni counter dan dinyatakan dalam jumlah kuman per ml bahan.

Masing-masing pengenceran diambil 1 ml diinokulasikan pada media Nutrient Agar dengan sistem tuang, Kemudian diinkubasikan pada suhu 370 C selama 24-48 jam. Koloni yang tumbuh dihitung sebagai Total Plate Count (TPC). - Dari pengenceran 10-1, diambil 0,1 ml diinokulasikan pada media Mac Conkey agar untuk pengujian E.coli.

3).Konfirmasi untuk Coliform dan F. Sampel dari setiap pengenceran (10-1, 10-2,10-3) diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 3 tabung yang berisi lactose broth dan Brilliant Green Bile (BGB) 2%. Broth diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya gas pada tabung tersebut dan selanjutnya dihitung

4). PEMBIAKAN SAMPEL (1).Nutrien Agar (2).SS Agar (3).Mac Conkey Agar Dari tiap pengenceran di atas diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam petridish Tuangkan sebanyak 15-20 ml nutrien agar ke dalam petridish tersebut di atas Goyangkan cawa petridish sedemikian rupa sehingga sampel dan agar tercampur merata Setelah agar membeku, balikkan cawa petridish dan inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Hitung koloni yang tumbuh

(2). SS Agar Ambil satu sengkelit sampel dari pengenceran di atas dan goreskan pada permukaan media SS Agar secara zigzag Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Amati koloni yang tumbuh Bila ditemukan koloni tidak berwarna/ bening, maka koloni tersebut tersangka sebagai Salmonella

(3). Mac Concey Agar Ambil satu sengkelit sampel dari pengenceran di atas dan goreskan pada permukaan media MC Agar secara zigzag Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Amati koloni yang tumbuh Bila ditemukan koloni berwarna merah jambu, bulat dan besar, maka koloni tersebut tersangka sebagai E.coli

PENETAPAN KOLONI KAPANG Prinsif : Pertumbuhan kapang dalam media yang cocok setelah diinkubasi pada suhu 25 o C – 30 o C selama lima hari. Cara kerja sama dengan penetapan TPC bakteri/ALT Pada pemeriksaan kapang menggunakan media Potato Dextrose Agar ( PDA) Inkubasikan pada suhu 25 o C – 30 o C selama lima hari Pada hari kelima dilihat pertumbuhan koloni, warna dan struktur Koloni kapang biasanya buram, abu-abu, kehitaman dan seperti kapas Tegaskan koloni kapang dengan pemeriksaan di bawah mikroskop Bila ditemukan spora/konidia, strigmata berarti Aspegillus (+)

B. Metode MPN (Most Probably Number) Penentuan MPN presumptive coliform - Pada pemeriksaan ini dipakai laktosa broth - Siapkan 7 tabung reaksi yang berisi LB sebanyak 10 ml - Pipet sampel 10 ml, lalu masukkan ke dalam tabung 1-5 - Pipet sampel 1 ml, lalu masukkan ke tabung 6 - Pipet sampel 0,1 ml, lalu masukkan ke dalam tabung 7 - masing-masing tabung dihomogenkan - Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam - Hasil (+) dinyatakan dengan terbentuknya gas pada tabung durham dan dilanjutkan dengan tes penegasan - Hasil (-) berarti coliform negatif dan tidak perlu dilakukan tes penegasan

Multiple tube fermentation (MPN) method The presumptive step (left) lauryl tryptose broth lactose broth (LB) The confirmed step (right) brilliant green lactose bile broth (BGLBB) Incubation at 35 oC for 24 h. The negative tube(left) No gas The positive tube (right) gas formation

Multiple tube fermentation method Water sample 10 ml 0.1 ml 0.01 ml LB INCUBATE,at 37 °C, 24 h Gas production No gas Reincubted, 24 h Positive Negative Presumptive test Confirmed test -Positive (Gas) -Negative (No gas) Reincubted, 24 h MPN Table BLGBB, incubated,at 37°C, 24 h

Multiple tube fermentation method Completed test Positive BLGBB tubes EMBagar, incubated,at 37°C, 24 h Typical colonies of E.coli (Metallic sheen) Gram’s staining Biochem test IMViC = ++-- TSA/NA slant LB +

Prosedur pengujian total coliform dengan metode MPN (FDA, 1995)

2. Test Penegasan Dari tiap tabung yang positif pada test awal, dipindahkan 1-2 ose ke dalam tabung yang berisi 10 ml BGLB 2 %. Dari masing-masing tabung penegasan diinokulasikan ke dalam dua seri Satu seri tabung BGLB 2 % diinkubasikan pada suhu 37o C selama 24 jam untuk coliform. Satu seri tabung BGLB lainnya diinkubasikan pada suhu 44 o C selama 24 jam untuk colifecal Pembacaan dilakukan setelah 24- 48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB yang menunjukkan (+) gas. - Kemudian dicocokkan dengan tabel MPN Hoskin J.K dan hasilnya dinyatakan dalam faecal coliform /gr sampel.

Detection of Coliforms Gas + Acid from Lactose 95 % of Coliforms Gas + Acid from Lactose at 44°C ONLY 90 % of E.coli Tryptophanase 99 % of E.coli are Indole positive

Tabung positif : 5 4 1

Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya. Misalkan . Diperoleh kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml.

3. Identifikasi dengan pengecatan Gram Pengecatan gram adalah cara pewarnaan differensial yang dapat membedakan bakteri ke dalam dua golongan besar yakni bakteri positif Gram dan Negatif Gram. Bakteri positif Gram dapat mempertahankan zat warna pertama ( primary stain) yaitu ungu kristal karbol sedangkan bakteri Negatif Gram melepaskan zat warna pertama dan mengikat zat warna kedua yaitu Safranin ( counstain). Dengan menggunakan ose steril, ambil koloni tersangka dan buat sediaan pada objek gelas kemudian difiksasi dengan lampu spiritus. Tetesi dengan larutan Gentian Violet 5 % selama 5 menit lalu cuci dengan air mengalir.

Tetesi larutan Lugol 1 % selama 1 menit kemudian bilas dengan air. Bilas dengan larutan alkohol 96 % sehingga tidak ada zat warna pada sediaan Tetesi dengan larutan Karbolfuchsin selama 3 menit kemudian bilas dengan air dan keringkan dengan menggunakan kertas saring Amati dengan mikroskop lensa objektif pembesaran 100 x dengan menggunakan oil emersi

Mikroskop dan Staining

PENGECATAN GRAM Warna yang ditimbulkan selama proses pengecatan gram Sel-sel pada gelas preparat Cat utama crystal violet Warna ungu Warna ungu Mordan, Gram Iodin Tetap ungu Tetap ungu Peluntur cat, Alkohol Menjadi tidak berwarna Tetap ungu Cat penutup (lawan), Safranin Tetap ungu Merah muda

4. Identifikasi Strain Escherichia coli O157:H7 Setelah penanaman Escherichia coli suspect pada Media SMAC akan terlihat koloni warna merah dengan zona jernih disekitarnya menunjukkan bahwa suspect positif Escherichia coli O157:H7, karena lambat dalam memfermentasikan sorbitol. Sedangkan yang bukan strain O157:H7 akan memberikan gambaran berawan warna merah jambu tanpa zona. Terhadap koloni ini kemudian dilakukan pengujian serologis yaitu dengan Latex Aglutinasi buatan Oxoid. Positif akan menunjukkan agglutinasi dengan gambaran yang halus. c. Sebagai kontrol diuji juga Escherichia coli O157:H7 dan Escherichia coli O157:H7 standar

5.UJI BIOKIMIA Uji ini bertujuan untuk menentukan spesies bakteri Ambil satu koloni dari nutrient agar dengan jarum ose Suntikan ke dalam bouillon satu ml Inkubasikan pada 37o C selama 20 menit Sesudah tumbuh tanam ke : Indol, MSA, Simon Sitrat, TSIA dengan menggunakan Ose cincin dan jarum Inkubasikan jajaran warna tersebut dalam inkobator pada 37o C selama 24 jam Amati perubahan yang terjadi Indol : Hasil (+) bila terjadi cincin merah jingga keunguan Hasil (-) bila tidak berubah atau warna kuning kecoklatan

IMViC Test ( Uji Indol, Methyl Red ( M), Voges proskauer(Vp), Koser’s Citrat ( KC) Indole MR- VP Citrate

MSA : Hasil (+) bila terjadi warna kuning Hasil (-) bila tidak berubah atau warna tetap orange Simon Citrat : Hasil (+) bila terjadi perubahan warna hijau menjadi biru Hasil (-) bila tidak berubah warna TSIA : Hasil (+) bila terjadi perubahan pada bagian tegak warna kuning dengan atau tanpa warna hitam ( H2S). Pada bagian miringnya warna merah atau tidak berubah

Bila tersangka Staphylococcus maka dilakukan Test Katalase ( H202) Ambil satu sengkelit koloni tersangka Staphylococcus Letakkan di atas objek gelas Teteskan H202 dua tetes Bila terjadi gelembung udara berarti (=), bila tidak terjadi berarti (-).

6.Salmonella pada bahan makanan Salmonella merupakan bakteri pathogen Pada proses pengolahan yang baik jumlah Salmonella dapat serendah 1 sel/25 gram sampel, atau tidak terdeteksi Salmonella - mengalami injur Deteksi lebih kompleks - AOAC 1992, 1995

Tahapan isolasi dan identifikasi Salmonella 1. Pre-enrichment Menyehatkan kembali sel yang luka karena proses pengolahan dan penyimpanan makanan sehingga dapat mencapai kondisi fisik yang stabil 2. Selective Mendukung pertumbuhan bakteri Salmonella dan enrichment menekan pertumbuhan bakteri kompetitif lain 3. Uji selektif padat Salmonella dapat tumbuh dan bakteri non Salmonella terhambat 4. Uji pendugaan Uji penetapan terhadap koloni Salmonella yang tipikal 5. Karakterisasi Menggunakan Kit diagnostik komersial biokimiawi 6. Uji serologi Identifikasi dan klasifikasi serotype Salmonella

Membrane filtration method A cellulose membrane pore size ~ 0.47 um in diameter Bacterial cells can not pass through Procedure the water sample is filtered through the membrane incubated for 24 h. at 35 oC in a special media specific for coliform bacteria

The filter is incubated in special media Membrane filtration method The filter is incubated in special media at 35 or 37 oC (left), Coliform bacteria produce colonies with a characteristic "metallic green sheen" at a 44.5 oC , (right), Fecal coliforms appear as blue colonies.

MORFOLOGI JAMUR Pengamatan morfologi jamur dengan mikroskop: Hifa: bersepta atau tidak, transparan atau keruh, berwarna atau tidak, jika ya, tentukan warnanya! 2. Spora seksual: oospora, askospora, basidiospora, atau yang lain. 3. Spora aseksual: sporangiospora, konidiospora,arthrospora, atau yang lain. Tentukan bentuk, struktur, dan ukuran. 4. Badan buah: sporangium, bentuk, warna, ukuran, dan letak. Bila menghasilkan konidia, tentukan tipe, ukuran, letak metula, fialida, uniseriate, biseriate, atau mono-, bi-, ter-, quarter-versilata, beraturan atau tidak. Struktur morfologi pada Aspergillus Conidia Fialida Metula Vesikel Stipa Spora seksual

5. Dasar badan buah: berupa kolumela, vesikula, tentukan bentuk dan ukuran! 6. Pendukung badan buah: tunggal atau dalam bentuk berkas, bercabang atu tidak? 7. Bentuk-bentuk khusus: misalnya stolon, rhizoid, sel kaki, apofisa, khlamidospora, atau bentuk khusus lainnya.

Terima kasih Hatur Nuhun Matur Nuwun