Gde Sutawijaya Pembimbing: Zeily Nurachman, D.Sc Seminar Tugas Akhir 26 Mei 2010 KARAKTERISASI DAN PEMURNIAN XILANASE DARI BAKTERI RAYAP Reticulitermes santonesis Gde Sutawijaya Pembimbing: Zeily Nurachman, D.Sc Institut Teknologi Bandung

Agenda Presentasi Pendahuluan Tinjauan Pustaka Metodologi Hasil Kesimpulan

Pendahuluan Adanya kemampuan hemiselulotik dari rayap Kebutuhan akan adanya agen bleaching kertas yang ramah lingkungan Kebutuhan energi yang meningkat

Tujuan Mengekstraksi xilan dari tongkol jagung Memproduksi enzim xilanase menggunakan substrat xylan tongkol jagung Memurnikan enzim xilanase menggunakan FPLC dengan kolom DEAE

Tinjauan Pustaka Xilanase (EC 3.2.1.8) Xilanase menghidrolisis ikatan (1->4)-beta-D-xylosidic pada xilan Xilanase menghasilkan xiloligosakarida dan xilosa

Tinjauan Pustaka

Tinjauan Pustaka Tongkol jagung Kandungan tongkol jagung : selulosa 44,9%, hemiselulosa (31,8%), dan lignin 23,3%, dan komponen lainnya (Titi Sunarti (IPB) dan Nur Richana (BB Pasca Panen Pertanian)).

Metodologi Persiapan tongkol jagung Ekstraksi xilan dari tongkol jagung Produksi xilanase Pemurnian xilanase Karakterisasi xilanase

Tongkol jagung yang telah dipotong Metodologi 1. Persiapan tongkol jagung Tongkol jagung Kering Dipotong kecil-kecil Tongkol jagung yang telah dipotong Digiling Tongkol Jagung halus

Metodologi 2.Ekstraksi xilan dari tongkol jagung filtrasi Delignifikasi dengan NaOCl 1% (10:1), 5 jam, suhu kamar Padatan diambil, dan dikeringkan Pengasaman dengan HCl Supernatan diambil dengan cara sentrifugasi Ekstraksi xilan menggunakan NaOH

Metodologi Xilan dikeringkan dihaluskan Xilan

Metodologi 3.Produksi xilanase Pembuatan media padat dan cair 1.Komposisi media padat K2HPO4 1,5% MgSO4.7H2O 0,025% NaCl 0,25% NH4Cl 0,5 % NH4PO4 0,5 % Yeast 0,2% Xilan 0.5% Bacto agar 2%   2. Media cair untuk produksi enzim Komposisi NH4Cl 0,5% Xilan 0,5%

Metodologi Penanaman bakteri/pembuatan koloni tunggal

Metodologi Produksi xilanase 20 mL kultur starter dishaker selama 12 -15 jam pada 150 rpm, 37°C, setelah itu dimasukan ke dalam media produksi enzim 200 mL (dalam erlenmeyer 1L). Media produksi di-shaker dalam 20 jam pada 150 rpm, 37°C. Enzim yang dipanen disentrifuga pada 5000 rpm untuk menghilangkan debris sel

Fraksinasi Enzim dengan (NH4)2SO4 Enzim hasil dialisis Padatan Supernatan Crude Enzim Xylanase 1L *Diresuspensi dengan buffer tris-HCl pH 8.0 20 mM * Didialisis +106g(NH4)2SO4 (Fraksi 0-20) *Disentrifugasi pada 11000 rpm, 30 menit Tujuannya untuk mengendapkan protein dengan prinsip salting out

Dialisis Dialisis bertujuan untuk membersihkan amonium sulfat dari protein, prinsipnya dengan perbedaan konsentrasi, dimana konsentrasi garam di dalam membran lebih besar daripada di luar membran

FPLC Fast Performance Liquid Chromatography Merupakan pemisahan dengan memanfaatkan perbedaan migrasi suatu dari senyawa pada fasa diam dan fasa gerak. Digunakan kolom penukar anion DEAE-Sepharosa yang bekerja berdasarkan perbedaan muatan dalam protein

Uji Aktivitas Xilanase Dari Bakteri Rayap Pembuatan DNS 0,05 gr DNS ditimbang dan dilarutkan dalam 25 ml NaOH 2 M, ditambahkan Na-K tartarat 15 gram, diencerkan dengan aqua dm hingga 50 ml, dan disimpan dalam suhu 4⁰C. Pembuatan Enzim Sampel enzim 50 µL dan substrat 450 µL diinkubasi pada 60oC selama 5 menit. Kemudian ditambah dengan DNS 500 µL dan diinkubasi di dalam air mendidih 5 menit Pembuatan Enzim Kontrol substrat 450 µL dan diinkubasi pada 60oC selama 5 menit kemudian dicampurkan dengan DNS 500 µL dan ienzim 50 µL, dan diinkubasi di dalam air mendidih 5 menit

Hasil Kromatogram dari FPLC Aktivitas enzim Kadar protein

Puncak-puncak kromatogram menunjukan adanya aktivitas enzim

Uji Aktivitas dengan metoda gula pereduksi (reagen DNS) Sampel  A1  A3  Median    Faktor Pengenceran  Akktivitas (U) fraksi 24 0.02 0.014 0.018 0.017 51.89 6.77 kali 1.381 9.349 fraksi 23 0.008 0.012 0.009 0.01 50.61 1.347 9.119 fraksi 11 0.164 0.179 0.172 77.61 2.065 13.98 Fraksi 7 0.621 0.646 0.626 0.631 154.2 4.103 27.78 Crude 0.71 0.68 0.69 0.693 164.6 4.379 29.65 Dialisis 1 0.624 0.61 0.415 118.1 100 kali 3.143 314.3 Terjadi peningkatan aktivitas setelah fraksinasi 0-20% sebesar 10,8 kali

Penentuan kadar protein

Penentuan kadar protein Konsentrasi protein A1 A2 A3 A 4 0.072 0.07 0.078 0.071 8 0.121 0.119 0.12 12 0.189 0.191 0.188 16 0.238 0.25 0.268 0.252 20 0.328 0.311 0.305 0.315 Ekstrak kasar = 1.00 = 66 µg/mL Fraksi 6 = 0.113 = 7,2 µg/mL Fraksi 7 = 0.14 = 9 µg/mL

Pembahasan Puncak-puncak pada kromatogram menunjukan adanya aktivitas enzim, namun untuk memastika nenzim tersebut adalah xilanase, perlu diuji dengan metoda DNS. Sebelumnya juga telah diuji aktivitas xilanase terhadap tongkol jagung, dan ternyata xilanase ini tidak dapat menguraikan tongkol jagung mentah

Kesimpulan Aktivitas xilanase dari bakteri rayap tergolong besar Dari data bisa dilihat bahwa terjadi peningkatan aktivitas dengan fraksinasi amonium sulfat.

Ucapan Terimakasih Pak Zelly, teh Inda, bu Iis, pak Yayat, kak Edo untuk bimbingan dan motivasinya Teman-teman 2006 sebimbingan, Tita, Ricky, Asro Teman-teman kimia untuk bantuan dan semangatnya Peserta seminar ini

Diskusi Knowledge only gained through coriousity