UJI TOKSISITAS AKUT LC-50 DAN KHRONIS TERHADAP Daphnia carinata KING Yayat Dhahiyat Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Program Pascasarjana Magister Ilmu Lingkungan UNIVERSITAS PADJADJARAN

Pentingnya biomonitoring Limbah dan lahan bekas penembangan urgen dilakukan uji toksisitas Leaking kedalam hidrosfer Mengganggu organisme Dilakukan pemantauan beberapa periode Pasca Fitoremediasi---aman bagi organisme?

UJI TOKSISITAS * LC50 (median lethal concentration), konsentrtasi yang menyebabkan kematian sebanyak 50 % dari organisme uji yang dapat diestimasi dengan grafik dan perhitungan, pada suatu waktu pengamatan tertentu, misalnya LC 50 48 jam, LC50 96 jam. * EC50 (median effective concentration), konsentrasi dari bahan dalam air yang menyebabkan tidak matinya/immobilisasi/tidak bergerak 50% dari organisme uji. * Diperlukan dalam evaluasi pencemaran perairan, karena uji fisika dan kimia tidak cukup untuk menilai pengaruh pencemaran terhadap organisme perairan

Kegunaan Uji Toksisitas Menentukan kondisi lingkungan yang cocok untuk kehidupan organisme perairan Melihat pengaruh faktor lingkungan terhadap toksisitas limbah Menguji toksisitas limbah terhadap organisme uji

Kegunaan Uji Toksisitas Mengetahui kepekaan organisme perairan terhadap limbah dan zat pencemar Efektivitas metode pengolahan limbah Untuk memenuhi baku mutu kualitas air Merupakan persyaratan effluent/limbah cair Izin mermbuang suatu limbah cair

Faktor yang Mempengaruhi Toksisitas Variabilitas biologi: organisme uji tidak sama atau identik akan mempengaruhi kepekaan terhadap zat yang diujikan. Daphnia merupakan jenis crustacea yang berkembang biak secara partenogenetik, menghasilkan neonate > 90 % adalah betina Umur atau tingkatan/fase perkembangan: perbedaan umur dan fase perkembangan dalam daur hidupnya akan berbeda dalam kepekaannya terhadap konsentrasi bahan pencemar/toksikan Kualitas air: kesadahan (hardness), pH dan suhu air. Logam berat lebih toksik terhadap ikan pada air lunak daripada air dengan tingkat kesadahan tinggi. Toksisitas amonia dan cyanida lebih kuat pada suhu rendah (3o C) daripada suhu tinggi (13o C).

Jenis Uji Toksisitas (berdasarkan lama exposure) Uji Toksisitas Akut (LC50): waktu exposure/pendadahan/pemaparan relatif pendek 48 jam dilakukan untuk Daphnia, 96 jam untuk ikan, lethal/mati Uji Toksisitas Chronis: waktu relatif lama, 21 hari (uji reproduksi) untuk Daphnia, sepanjang daur hidup,atau 1/10 daur hidupnya, uji pertumbuhan

LC50 Lethal Concentration LC50: konsentrasi dimana dapat membunuh 50 % organisme uji pada waktu tertentu, misalnya 48 jam LC50 biasanya untuk Daphnia atau organisme yang mempunyai daur hidup pendek. 96 jam LC50, biasanya untuk ikan atau makroinvertebrata.

JENIS UJI TOKSISITAS (berdasarkan larutan uji) Static test: larutan dan organisme uji disimpan dalam wadah uji selama uji berlangsung, misalnya selama 48 atau 96 jam, tidak diganti Renewal test: larutan uji yang sama komposisinya diganti secara berkala selama uji dilakukan, pergantian larutan selama 24 jam sekali

Jenis Uji Toksisitas (lanjutan) Flow through test: uji dengan air yang mengalir, mendekati keadaan di lapangan; larutan uji diganti terus menerus selama test berlangsung

Kriteria Organisme Uji Tersedia luas melalui kultur laboratorium, tempat pemijahan atau pengambilan di lapangan dan tersedia dalam jumlah yang mencukupi Secara genetik dan sejarah pengkulturannya harus diketahui dengan jelas

Kriteria Organisme Uji Peka terhadap berjenis-jenis bahan racun/toxicant Indigenous species/organisme uji merupakan jenis asli pada suatu lokasi Mempunyai nilai ekologi dan ekonomi yang tinggi

Organisme Uji Daphnia spp Secara genetik dan sejarah perkulturannya sudah diketahui denagn jelas, mudah dikultur di laboratorium Ukuran kecil (neonates + 1 mm) hanya memerlukan wadah percobaan kecil Peka terhadap bahan pencemar, telah diujikaan terhadap lebih dari 500 bahan kimia Banyak rujukan yang dapat digunakan, sudah dikenal secara global Tersebar luas di perairan tawar, dan tersedia dalam jumlah yang banyak Mempunyai siklus hidup yang pendek/relatif singkat Penting dalam rantai makanan di perairan, sebagai pakan alami bagi ikan

KULTUR DAPHNIA Cara paling sederhana dengan mencampur 5 gram kotoran kambing/domba, 25 gram tanah (top soil), dan 1 liter air tanah dalam suatu wadah. Tutup dan biarkan selama 2 hari pada suhu kamar Kemudian disaring, dengan ukuran saringan 0,15 mm. Filtrat dapat digunakan setelah 1 minggu atau lebih, kemudian diencerkan 6-8 kali dengan air tanah. Pakan Daphnia berupa pakan alami dan makanan buatan Pakan alami adalah algae, misalnya Ankistrodesmus, Selenastrum, Chlamydomonas, dan Chlorella. Pakan buatan adalah makanan ikan dan ragi roti.

Jenis Organisme Uji Ikan: ikan mas (Cyprinus carpio), tawes (Puntius javanicus) Udang/Crustacea: Udang windu (Penaeus monodon) Diatomae (Skeletonema costartum) Kerang (Mytilus edulis) Plankton: Zooplankton (Daphnia carinata) dan Fitoplankton (Selenastrum capricornatum)

Organisme Uji (berdasarkan negara) USA & Canada: Mysidopsis bahia, Daphnia magna dan D. pulex Inggris: Udang coklat (Crangon crangon), D. magna. Belanda: Crangon crangon, D. magna Australia: Mytilus edulis, Penaeus monodon, Skeletonema costartum Indonesia: Cyprinus carpio, Penaeus monodon, Daphnia carinata.

Organisme Uji (berdasarkan habitat) Air tawar/fresh water: Ikan mas, kutu air (Daphnia spp), Anabaena flos-aquae, Selenastrum capricornatum Air laut/marine/brackish water: Crangon crangon, Penaeus monodon, Mysidopsis bahia, Mytilus edulis.

Metode Uji Toksisitas OECD (Organization for Economic Cooperation and Development) FAO (Food and Agriculture Organization) EPS (Environment Protection Series/Environment Canada) ASTM (American Society for Testing and Materials) US-EPA (US-Environmental Protection Agency) APHA (American Public Health Association/Standard Method)

Prosedur Uji Toksisitas Jumlah hewan uji 10 ekor (minimal) Umur/ukuran: Daphnia spp: < 24 jam (neonates), 1 mm Neonate yang digunakan keturunan kedua atau ketiga Perlakuan: 5 perlakuan, ditambah 1 kontrol Ulangan: 3 kali Uji dapat dilakukan pada inkubator, agar suhu dan photoperiodis dapat diatur. Suhu sekitar 24-26o C, photoperiodis 12 jam terang/gelap. Agar dapat mudah dilakukan pada ruangan laboratorium, dengan suhu kamar, dan photoperiodis 12 jam terang/gelap

Uji Pendahuluan (Critical Range Test) Sebagai dasar untuk menentukan Uji LC50 Konsentrasi yang digunakan yang menyebabkan kematian terbesar/seluruh hewan uji dan kematian terkecil/atau tidak ada yang mati. Dapat digunakann konsentrasi kecil sampai besar (misalnya 0,01, 0,1, 1, 10 dan100 %) konsentrasi yang digunakan berdasarkan seri logaritmik untuk uji LC50 Neonates dimasukkan ke dalam beaker yang telah berisi larutan uji, secara acak/random Dilakukan selama 24 jam dan 48 jam Uji LC50, dilakukan dengan konsentrasi seri geometrik, misalnya 6,25 %, 12,5, 25, 50, 100 %

Seri Logaritmik untuk Menentukan Konsentrasi Kolom (Jumlah Konsentrasi antara 100 dan 10, atau antara 10 dan 1)** 1 2 3 4 5 6 7 100 32 10 3,2 1,0 46 22 4,6 2,2 56 18 5,6 1,8 63 40 25 16 6,3 4,0 2,5 1,6 68 15 6,8 1,5 72 52 37 27 19 14 7,2 5,2 3,7 2,7 1,9 1,4 75 42 24 13 7,5 4,2 2,4 1,3

Prosedur (lanjutan) Uji dilakukan pada beaker glass 250 ml, 10 ekor dalam 150 ml cairan uji Pindahkan neonate dari wadah kultur dengan menggunakan pipet, satu persatu ke beaker I, II, III, IV, V dan kontrol. Pemindahan tidak sekaligus dalam beaker, ini merupakan salah satu cara random/acak Diamati setiap 24 jam, kalau ada yang mati diambil, dicatat pada perlakuan mana Uji berakhir setelah 48 jam dengan mencatat semua organisme yang mati Selama uji tidak diberi pakan dan tidak perlu diaerasi. Aerasi dilakukan sebelum percobaan, sampai jenuh.

GENOTOKSIKOLOGI GENOTOKSIKOLOGI: PENGARUH TOKSIKANT/BAHAN PENCEMAR TERHADAP SISTEM GEN ORGANISME UJI COMMET ASSAY: PENGGUNAAN IKAN COMMET UNTUK UJI GENOTOKSIKOLOGI PENGARUH: MUTAGENIK, MUTASI

ANALISIS DATA Analisis data yang paling umum dengan PROBIT ANALYSIS, berbentuk program komputer, antara lain 1. Duluth-Tox (C.Stepan), Duluth Environmental Protection Agency’s Environmental Research Laboratory 2. ASTM-Probith (C.Stepan), ASTM Committee E-47 3. SPSS-Probit, SPSS Statistical Program 4. SAS-Probit, SAS Statistical Program 5. Micro Probit 3.0, Probit Analysis for the IBM PC & Compatibles, Copyright 1982, 1986, 1987 by Dr. Thomas C & Alexandra Sparks

ANALISIS DATA (lanjutan) 1. Parametric procedure; probit analysis dan logit method 2. Non-parametric; Spearman-Karber Method 3. Numerical interpolation technique; graphical interpolation, binomial distribution

TOXICITY RATING (APEA & ERDC, 1994) 1. Sangat toksik, 1 ppm 2. Toksik, 1-100 ppm 3. Toksik sedang, 100-1.000 ppm 4. Agak toksik, 1.000-10.000 ppm 5. Hampir tidak toksik, 10.000-100.000 ppm 6.Tidak toksik, 100.000 ppm

Komisi Pestisida, Departemen Pertanian Kriteria Toksisitas LC50-96 jam 1. Toksisitas rendah, > 100 mg/L 2. Sedang, 10-100 mg/L 3. Tinggi, 1-10 mg/l 4. Sangat Toksik, < 1 mg/L

PENGARUH TOXICANT 1. MEKANISME DAN LOKASI TARGET: HATI, GINJAL, INSANG DLL. 2. PENGARUH: MUTAGENIK, CARCENOGENIK 3. PENGGUNAAN: PESTISIDA, HERBISIDA, FUNGISIDA DLL. 4. KONDISI FISIK: CAIRAN/PADATAN 5. POTENSI TOKSISITAS: SANGAT BERACUN, BERACUN, TIDAK BERACUN 6. PENGARUH TERHADAP ORGANISME PERAIRAN: MENCEMARI, MEMATIKAN 7. SIFAT TOXICANT: BIOAKUMULASI, PERSISTENT DLL.

Rangkuman Penggunaan LC50 dalam uji toksisitas/uji toksikologi telah sangat berkembang, berbagai organisasi international dan negara telah menerbitkan metode dan menggunakan hasil ini untuk menentukan tingkat toksisitas suatu bahan/toksikan. Berbagai organisme mulai hewan tinkat rendah/plankton, sampai ikan telah banyak digunakan sebagai organisme uji. Analisis data untuk menginterpretasi hasil telah digunakan mulai dari interpolasi garis, sampai program komputer. Telah ada standard/baku mutu yang menentukan tingkat toksisitas yang dikeluarkan dan diakui secara internasional Indonesia dalam hal ini belum menentukan uji LC50 dalam menentukan B3, tetapi dengan LD50.