Proposal Payung Penelitian Polimorfisme dan Isoform Gen Reseptor Gonadotropin dan Hormon Sex Steroid : Implikasinya Pada Infertilitas dan Kesehatan Reproduksi Departemen Biologi Kedokteran Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia 2005

Fertilitas: - adalah salah satu fase penting yang menentukan kelangsungan hidup manusia. - berimplikasi pada masalah kependudukan, distribusi kesejahteraan dan kesehatan reproduksi.

Angka kejadian infertilitas di Indonesia ± 10% Angka kejadian infertilitas di Indonesia ± 10%. Infertilitas dapat terjadi karena : - faktor wanita 45% - faktor pria 40% - faktor idiopatik 15% Infertilitas dapat disebabkan perubahan keseimbangan (keserasian) pengaturan horman reproduksi, yang termasuk dalam poros hipotalamus – hipofisis - gonad

Interaksi Gonadotropin dengan Sel Target Reseptor FSH dan LH adalah protein permukaan (membran sel) Interaksi FSH dan LH dengan reseptor mengaktifkan protein G yang meneruskan isyarat ke efektor adenil siklase Adenil siklase menterjemahkan isyarat dengan mensintesis “second messenger” cAMP dari ATP cAMP mengaktifkan enzim-enzim fosforilase kinase yang secara bertahap mengaktifkan enzim untuk reaksi-reaksi seluler, sebagai manifestasi reaksi sel terhadap hormon

Skema interaksi FSH dengan sel target

Interaksi Testosteron dengan Sel Target Testosteron berdifusi melalui membran sel target, bergabung dengan reseptor dalam sitoplasma Translokasi kompleks hormon-reseptor ke nukleus Transformasi kompleks hormon-reseptor menjadi “DNA binding protein” “DNA binding protein” membentuk dimer pada promoter dan berasosiasi dengan “transcription factor” e.g. RNA polimerase Transkripsi lokus/gen target dalam khromatin

Reseptor FSH / LH (FSHR / LHR) Protein membran sel terdiri dari domain ekstraseluler pada N terminal, domain transmembran dan domain intraseluler pada C terminal Domain ekstraseluler berfungsi sebagai “ligand binding domain” dengan beberapa LRR (“leucine reach repeat”) Domain transmembran terdiri dari 6 segmen polipeptida Dikode oleh gen pada lokus 2p21 : FSHR  54 kb ; 10 exon 9 intron LHR  70 kb ; 11 exon 10 intron

Reseptor Androgen Reseptor sitoplasmik terdiri dari domain transaktivasi pada N terminal, domain “DNA binding” dan domain “ligand binding” pada C terminal Berfungsi sebagai “transcription factor” inaktif dalam keadaan bebas dan berasosiasi dengan hsp (“heat shock protein”) Menjadi aktif bila berikatan dengan ligand dan terpisah dari hsp Dikode oleh gen pada khromososm X terdiri dari 8 exon, 48 kb.

Mutasi & Polimorfisme gen reseptor : mengubah struktur primer dan konformasi molekul reseptor. mengubah afinitas reseptor terhadap hormon mengubah respon sel/organ terhadap stimulasi hormon

Mutasi  point mutation multibase mutation  aktivasi / inaktivasi Mutasi  point mutation multibase mutation  aktivasi / inaktivasi (frekuensi kecil) Polimorfisme  menghasilkan isoform (alel)  terdistribusi di dalam populasi diturunkan secara Mendel

Polimorfisme Gen Reseptor Gonadotropin Perubahan tingkat nukleotida, menghasilkan variasi alel dan mengekspresikan isoform FSHR / LHR Varian alel terdistribusi di dalam populasi dan bersegregasi menurut Hukum Mendel Menentukan kapasitas sel target untuk menerima stimulasi hormon, menyebabkan perbedaan ambang respon gonad terhadap FSH / LH pada individu berbeda

Analisa Polimorfisme gen FSHR : 1 Analisa Polimorfisme gen FSHR : 1. Polimorfisme pada domain ekstraseluler posisi kodon 307 : alanin (Ala) disubstitusi threonin (Thre) 2. Polimorfisme pada domain intraseluler posisi kodon 680 : Asparagin (Asp) disubstitusi serin (Ser) Analisa SSCP dan RFLP posisi 307 dan 680 gen FSHR : - Thre307 terangkai Asn680 , Ala307 terangkai Ser680 pada etnis Kaukasia. - Genotip Asn/Asn, Asn/Ser, Ser/Ser terdistribusi di dalam populasi dengan proporsi bervariasi (dalam keseimbangan HW).

Polimorfisme reseptor androgen : Exon I gen reseptor androgen memiliki daerah pengulangan CAG yang sifatnya polimorfik. Polimorfisme pengulangan CAG pada gen reseptor androgen menyebabkan variasi poliglutamin yang menyusun domain transaktivasi reseptor androgen  aktifitas reseptor dalam mentransduksi sinyal androgen. Polimorfisme pengulangan CAG gen reseptor androgen telah diketahui berasosiasi dengan patogenesis penyakit tertentu.

Masalah : - Bagaimana mendeterminasi isoform reseptor gonadotropin dan hormon sex untuk mengevaluasi fungsi gonad dan perkembangan sexual pria maupun wanita dengan penyakit atau masalah reproduksi tertentu. - Bagaimana menganalisis polimorfisme gen reseptor gonadotropin dan hormon sex steroid untuk penanggulangan infertilitas dan pengelolaan kesehatan reproduksi.

Penelitian-penelitian yang sudah diselesaikan 1 Penelitian-penelitian yang sudah diselesaikan 1. Polimorfisme promoter gen reseptor FSH : Pengaruhnya terhadap aktifitas promoter dan sensitifitas ovarium pada wanita yang mengikuti program reproduksi berbantuan. 2. Polimorfisme gen reseptor FSH (FSHR) pada wanita yang mengikuti program reproduksi berbantuan. 3. Analisis polimorfisme pengulangan CAG gen reseptor androgen dan hubungannya dengan gangguan spermatogenesis pada beberapa pria Indonesia.

Model skematis daerah 5’ flanking gen RFSH manusia

Hasil elektroforesis amplikon DNA promoter FSHR pada gel SSCP (akrilamid 20%) wt -29 -114 -138 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Kesimpulan Penelitian 1 : Polimorfisme pada posisi –123 menyebabkan penurunan aktivitas promotor sebesar 47,4% relatif dari wt. Promotor reseptor FSH manusia polimorfik yang dibuktikan dengan ditemukannya empat polimorfisme pada posisi –29, –114, –123, dan –138. Frekuensi tertinggi ditemukan pada posisi –29 (>50%) sedangkan frekuensi ke-3 polimorfisme lainnya sangat rendah ( 0,3%). Ketiga genotip yang membawa isoform (alel) -29 tidak menunjukkan perbedaan level FSH basal dan kebutuhan ampul (dosis) FSH untuk menstimulasi ovulasi.

Peta gen struktur reseptor FSH

  Analisa SSCP exon 10 gen reseptor FSH posisi 680 menghasilkan 3 genotip (isoform) FSH Asn/Ser Ser/Ser Asn/Asn

Kesimpulan Penelitian 2 : 1 Kesimpulan Penelitian 2 : 1. Pola distribusi isoform reseptor FSH wanita Indonesia berbeda dengan yang terjadi pada wanita Kaukasia. 2. Wanita dengan genotip Ser/Ser mempunyai proporsi hampir sama (± 35%) pada populasi Indonesia, Cina, Kaukasia dan Suriname, sedangkan wanita dengan genotip Asn/Asn mempunyai proporsi bervariasi antara 11% - 36%. 3. Distribusi alel gen FSHR pada wanita anovulasi normogona- dotropik berbeda dengan distribusinya pada wanita normal. 4. Wanita Indonesia dengan genotip Ser/Ser mempunyai kadar FSH basal lebih tinggi dari genotip alternatifnya dan membutuhkan ampul (dosis) FSH lebih besar untuk menginduksi superovulasi.

Kesimpulan Penelitian 3 : Pada pria Indonesia : 1 Kesimpulan Penelitian 3 : Pada pria Indonesia : 1. Jumlah pengulangan CAG gen reseptor androgen pada pria oligozoospermia/azoospermia berbeda (lebih besar) dari pria normozoospermia. 2. Jumlah pengulangan CAG gen reseptor androgen tidak berkorelasi dengan konsentrasi spermato- zoa baik pada pria oligozoospermia maupun pria normozoospermia.

Publikasi yang telah dihasilkan Yuni Ahda (2004) Publikasi yang telah dihasilkan Yuni Ahda (2004). Polimorfisme promotor gen reseptor FSH : Pengaruhnya terhadap aktifitas promotor dan sensitivitas ovarium pada wanita yang mengikuti program reproduksi berbantuan. Disertasi S3, Program Pascasarjana (PPS) Biomedik, FKUI. Arfianti (2004). Analisis polimorfisme pengulangan CAG gen reseptor androgen dan hubungannya dengan gangguan spermatogenesis pada beberapa pria Indonesia. Tesis S2, Program Pascasarjana (PPS) Biomedik, FKUI. Y. Ahda, J. Gromoll, P. Soeharso, S. Inawati and N. Moeloek , (2004). Single nucleotide polymorphism of follicle-stimulating hormone receptor promoter and their impacts to the promoter activities. MJI 13(4) : 205 – 214.. P. Soeharso, Arfianti, N. Moeloek, (2004). The association of CAG repeat length polymorphisms of androgen receptor gene and spermatogenesis impairment in several Indonesian men. MJI 13(4) : 215 – 220. Y. Ahda, J. Gromoll, A. Wunsch, K. Asatiani, E. Nieschlag, M. Simoni, (2005). Single nucleotide polymorphisms of FSH receptor gene : Frequency and distribution of four common allelic variants in normozoospermic and azoospermic men. Int. J. Androl. (submitted). Yoop S.E. Laven, Annemary G.M.G., J. Mulders, Dwi A. Suryandari, J. Gromoll, E. Nieschlag, Bart C.J.M. Fauser, M. Simoni (2003). Follicle-stimulating hormone receptor polymorphisms in women with normogonadotrophic anovulatory infertility. Fertil. Steril. 80(4) : 986 – 992.

Presentasi dalam seminar P. Soeharso, D. A. Suryandari, Y. Ahda, N Presentasi dalam seminar P. Soeharso, D.A. Suryandari, Y. Ahda, N. Moeloek. The analysis of FSH receptor (FSHR) genotypes and FSHR promoter gene polymorphisms in Indonesian women undergoing controlled ovarian stimulation. 1st Asean Conference on Medical Sciences, Kelantan, Malaysia, 2001. P. Soeharso, Y. Ahda. The variation of luciferase reporter gene expression driven by the core promoter of human FSH receptor gene with different point mutation. 2nd Asean Conference on Medical Sciences, Medan, 2002. Dwi A. Suryandari, P. Soeharso, N. Moeloek. Analisis polimorfisme gen FSHR pada 51 wanita Indonesia. Seminar XV & Kongres IX PBBMI, Bogor, 2001. Y. Ahda, P. Soeharso, N. Moeloek. Analisis polimorfisme pada daerah inti promoter gen reseptor FSH dan korelasinya dengan polimorfisme pada gen reseptor FSH. Seminar XV dan Kongres IX PBBMI, Bogor, 2001.

P. Soeharso dan Arfianti P. Soeharso dan Arfianti. Polimorfisme pengulangan CAG gen reseptor androgen pada beberapa pria dengan kegagalan spermatogenesis . Seminar Nasional PBBMI, Yogyakarta, 2004. D. J. Wahyono, Dwi A. Suryandari, N. Moeloek, P. Soeharso. Perbandingan sensitivitas metoda PCR-SSCP dengan PCR-RFLP untuk deteksi polimorfisme kodon 680 ekson 10 gen FSHR. Seminar Nasional PBBMI, Yogyakarta, 2004. Dwi A. Suryandari, J. Gromoll, M. Simoni, P. Soeharso, N. Moeloek. polimorfisme gen FSHR pada wanita infertil anovulatori gonadotropik (WHO-2). Seminar Nasional PBBMI, Yogyakarta, 2004. Y. Ahda, J. Gromoll, P. Soeharso, S. Inawati, N. Moeloek. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) promotor reseptor FSH dan pengaruhnya terhadap aktifitas promotor. Seminar Nasional PBBMI, Yogyakarta, 2004.

Penelitian yang sedang direncanakan : Membuktikan keterkaitan isoform reseptor gonadotropin atau hormon sex steroid dengan penyakit / kelainan sistem reproduksi. 1. Polimorfisme gen reseptor FSH dan promoternya pada wanita yang mengalami menopause dini atau lambat secara natural. Latar belakang / dasar pemikiran - usia menopause wanita Indonesia adalah 40 – 50 tahun. - menopause berhubungan langsung dengan menurunnya fungsi ovarium. - Interaksi FSH dengan reseptornya berperanan penting untuk mempertahankan fungsi normal ovarium.

polimorfisme gen reseptor FSH dan promoternya sangat mungkin mempengaruhi cepat atau lambatnya penurunan fungsi ovarium  berimplikasi pada usia menopause  perlu dilakukan analisis polimorfisme gen reseptor FSH dan promoternya pada wanita yang mengalami menopause dini atau lambat.

2. Polimorfisme gen reseptor FSH dan estrogen pada wanita dengan endometriosis. Latar belakang / dasar pemikiran : - Endometriosis adalah penyakit/gangguan yang banyak dialami wanita usia reproduktif. - Patogenesis endometriosis telah diketahui berhubungan langsung dengan aktifitas estrogen. - Estrogen diseintesis melalui rangkaian reaksi yang melibatkan enzim aromatase dalam sel folikel. - Interaksi FSH dengan reseptornya dipermukaan sel granulosa menentukan respon ovarium untuk menghasilkan estrogen melalui aktifitas aromatase. - Jaringan endometriosis berkembang karena simulasi estrogen pada jaringan endometriosis melalui interaksinya dengan reseptor sitoplasmik (reseptor estrogen) dalam sel endometrium.

Patogenesis endometriosis mungkin disebabkan produksi estrogen yang berlebihan di dalam sel granulosa yang distimulasi FSH atau karena kinerja estrogen yang sangat efektif pada jaringan endometriosis. Isoform reseptor FSH mungkin terkait dengan aktifitas aromatase dalam sintesis estrogen dalam ovarium; sementara isoform reseptor estrogen mungkin mendukung efektifitas estrogen menstimulasi berkembangnya jaringan endometriosis.  analisis polimorfisme gen reseptor FSH dan reseptor estrogen pada wanita endometriosis perlu dilakukan untuk mengetahi pengaruh varian reseptor FSH dan reseptor estrogen pada patogenesis endometriosis baik sendiri atau bersama-sama.

3. Analisis polimorfisme gen reseptor FSH dan promoternya serta pengulangan CAG reseptor androgen dan hubungannya dengan tingkat fertilitas pria. Latar belakang / Dasar pemikiran : - spermatogenesis dikendalikan oleh 2 hormon yang saling menunjang yaitu FSH dan testosteron. - FSH menstimulasi sel Sertoli memproduksi aktivin untuk menginduksi proliferasi sel germinal. - testosteron memberi tempat ideal untuk berlangsungnya spermatogenesis dengan menginduksi tubulus seminiferus menjadi “adult type”. - interaksi sinergis FSH dan testosteron diperlukan untuk spermatogenesis yang fisiologis.

Efektifitas FSH pada sel sertoli dipengaruhi oleh variasi alel (isoform) reseptor FSH dan promoternya; Polimorfisme pengulangan CAG gen reseptor androgen berpengaruh pada respon sel target terhadap testosteron. Varian reseptor FSH dan/atau polimorfisme pengulangan CAG gen resptor androgen sangat mungkin mempengaruhi kwalitas spermatogenesis  menentukan tingkat fertilitas pria.

Tujuan dan Manfaat Penelitian : 1 Tujuan dan Manfaat Penelitian : 1. Mengetahui kinerja reseptor gonadotropin dan hormon sex steroid pada tingkat molekul. 2. Mengetahui pengaruh isoform reseptor FSH dan reseptor steroid pada beberapa kasus penyakit/kelainan sistem reproduksi, khususnya : menopause dini dan lambat endometriosis infertilitas pria  oligozoospermia azoospermia 3. Mengembangkan teknologi baru untuk mendeterminasi isoform gonadotropin dan hormon sex steroid. 4. Memberi informasi pada klinisi (dokter) akan pentingnya mendeterminasi isoform reseptor gonadotropin dan hormon sex steroid untuk memberi konsultasi atau pengobatan pasien yang mengalami gangguan fertilitas.

Metodologi : 1. Skrining sampel penelitian, dengan menerapkan faktor exklusi dan inklusi sesuai dengan tujuan penelitian. 2. Sample processing dan koleksi data. 3. Membuat kesimpulan dengan menginterpretasi data penelitian.

Sample processing dan koleksi data Sample processing dan koleksi data sampel darah dari donor (pasien / kontrol) extraksi DNA amplifikasi daerah polimorfik gen yang diinginkan dengan PCR menggunakan primer yang sesuai Amplikon (hasil PCR)

Amplikon (hasil PCR uji aktifitas gen. SSCP/RFLP Amplikon (hasil PCR uji aktifitas gen SSCP/RFLP sikuensing DNA untuk vitro konfirmasi situs polimorfik determinasi polimorfisme FSHR/reseptor steroid uji statistik interpretasi data

Kerjasama dengan institusi lain Kerjasama dengan institusi di luar FKUI 1. Institute for Reproductive Medicine (IRM), Munster, Germany. Memberi pendidikan dan training (pelatihan) teknologi laboratorium terkini. 2. US NAMRU, Jakarta. Memberi fasilitas lab. dan pelatihan beberapa teknik lab. 3. Rumah Sakit Harapan Kita, Jakarta. Kerjasama untuk koleksi sampel penelitian. 4. Rumah Sakit BUNDA, Jakarta. Kerjasama untuk koleksi sampel penelitian.

Kerjasama antar departemen di lingkungan FKUI 1 Kerjasama antar departemen di lingkungan FKUI 1. Departemen Obstetri dan Ginekologi FKUI-RSCM. Memberi konsultasi masalah klinis/reproduksi wanita dan koleksi sampel penelitian. 2. Departemen Biokimia dan Biologi Molekuler FKUI. Memberi fasilitas lab dan konsultasi teknik lab. 3. Klinik Kebidanan Raden Saleh. Kerjasama untuk koleksi sampel penelitian. 4. Departemen Bedah Urologi FKUI-RSCM. Memberi konsultasi masalah klinis/reproduksi pria dan koleksi sampel penelitian.