Kajian Dan Manajemen Struktur Komunitas Mikrobia Tanah Untuk Menekan Penyakit Dipresentasikan Oleh: Andi Suryadi Catur Joko Widodo João Boavida da Cruz

Pendahuluan Ekologi mikrobia tanah, dan pengaruhnya thd fungsi ekosistem tanaman, dinamika, dan produktivitas tanah saat ini banyak mendapatkan perhatian utk diteliti Komunitas mikrobia tanah, struktur dan fungsinya sangat komplek dipahami Para peneliti berusaha menerapkan metode2 yg dpt mengkaji komunitas mikrobia tanah tersebut

Metode Yang Digunakan Teknik tradisional : menjelaskan komposisi dan keragaman populasi mikrobia pd tanah didasarkan pada karakteristik fenotip.(terbatas pada organ yang bisa dikulturkan) Teknik molekuler : dapat menetukan ciri biologi/keragaman spesies-spesies mikrobia tanah

Pendekatan Karakterisasi Mikroflora Tanah Metode integratif : penekanan pada komposisi struktur dan fungsi komunitas mikrobia tanah berdasarkan pada pengaruh praktek, proses, atau gangguan pada aktivitas mikrobia tanah. Metode fisiologi dan molekular : didasarkan pada teknik berbasis kultur dan DNA

Metode Integratif Substrate Utilization Profile Fatty Acid Methyl Ester Profiles

Substrate Utilization Profile Mendeteksi perbedaan/pengaruh praktek pengelolaan diantara komunitas mikrobia Sistem BIOLOG®, didasarkan pd level fisiologi komunitas Sistem tersebut dipengaruhi o/ tipe tanah, spesies tumbuhan, inokulan mikrobia dan teknik budidaya Sistem BIOLOG (GN) didasarkan pada pemanfaatan 95 sumber karbon yg berbeda Tidak terlalu banyak memberikan sumbangan informasi

Fatty Acid Methyl Ester(FAME) Profiles Pemahaman sifat-sifat komunitas mikrobia yg didasarkan pd PLFA atau FAME PLFA adalah molekul penanda yg bermanfaat pd membran sel hidup Kelebihan : dapat langsung memberi informasi ttg struktur mikrobia tanah Kelemahan: komposisi dan keragaman komunitas mikrobia tdk dpt dijelaskan secara keseluruhan

Metode Fisioloig Dan Molekular DNA-Based Methods PCR Methods Real-Time PCR DNA Arrays Metagenomig Libraries

DNA-Based Methods Memiliki potensi yg luas utk memperluas pengetahuan ttg struktur dan fungsi komunitas mikroba Metode ini dpt menjelaskan komposisi phylogenetik dan status fungsional komunitas mikrobia

PCR Methods Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik amplifikasi sekuen DNA secara in vitro dengan jalan ekstensi secara simultan dari primer yang komplementer dengan DNA target. Primer tersebut berupa sepasang oligonukleotida yang mempunyai sekuen dan terletak pada DNA template yang mengapit (flank) segmen DNA yang akan diamplifikasi. Cetakan (template) DNA mula-mula didenaturasi dengan pemanasan di dalam campuran yang juga mengandung oligonukleotida primer dengan jumlah yang cukup banyak serta dNTP-deoxyNucleotida TriPhosphates (dATP, dCTP, dGTP & dTTP) yang bersifat enzymatic extension.

Proses dikelompokkan tiga tahap : Denaturasi template Annealing (penempelan) pasangan primer pd untai tunggal DNA target Extension (pemanjangan/polimerisasi) Ketiga tahapan tersebut dapat terus berulang sesuai dg jumlah siklus yang diinginkan

Schematic drawing of the PCR cycle. (1) Denaturing at 94-96°C Schematic drawing of the PCR cycle. (1) Denaturing at 94-96°C. (2) Annealing at (eg) 68°C. (3) Elongation at 72°C (P=Polymerase). (4) The first cycle is complete. The two resulting DNA strands make up the template DNA for the next cycle, thus doubling the amount of DNA duplicated for each new cycle (a total of three cycles is shown above).

s

Real-Time PCR Dapat mendeteksi sedikit banyaknya DNA jasad renik dari sampel lingkungan yg kompleks Telah digunakan scr permanen untuk studi penekanan penyakit Secara relatif beberapa studi telah menerapkan teknik ini utk esktrak DNA dr tanah

Sande Weert et al (1959), telah menguji penggunaan metode molekuler, termasuk Rt-PCR utk menekan pertumbuhan relatif, dan kemampuan bersaing dr 2 spesies jamur ektomikoriza pd akar pinus Analisa dilakukan dg DGGE, Rt-PCR thd ekstrak DNA dr tanah

Analisa molekuler dan PLFA  terdpt satu penambahan/perubahan yg tdk signifikan pd pertumbuhan jamur mikoriza yg diinokulasi scr individual Sebaliknya penggunaan semua metode molekuler (kecuali PLFA), mendeteksi suatu penambahan target DNA Sullius, dan penurunan kuantitatif DNA dr Paxillus ketika jamur tlh diinokulasikan pd bibit cemara

Pada penemuan ini menunjukkan bahwa S Pada penemuan ini menunjukkan bahwa S. bovines menghambat pertumbuhan dr P. involutus Mendemonstrasikan kemampuan molekular dlm mempelajari interaksi antara mikroorganisme, yg tidak dapat dipelajari dg pendekatan fisiologi

DNA Array Metode DNA array digunakan untuk identifikasi isolat Phytium spp dan Phytophthora spp yg belum diketahui. Phytium spp mrp penyakit penting pd apel Bbrp spesies dilaporkan dpt berasosiasi dg tanaman tahunan

cDNA arrays: the process Building the Chip: PCR PURIFICATION and PREPARATION MASSIVE PCR PREPARING SLIDES PRINTING Preparing RNA: CELL CULTURE AND HARVEST RNA ISOLATION cDNA PRODUCTION Hybing the Chip: ARRAY HYBRIDIZATION PROBE LABELING DATA ANALYSIS POST PROCESSING

DNA Array

cDNA arrays in summary excitation scanning cDNA clones (probes) laser 2 laser 1 emission PCR product amplification purification printing mRNA target) overlay images and normalise 0.1nl/spot Hybridise target to microarray microarray analysis

Analisa DNA Array meningkatkan deteksi Phytium pd kebun buah-buahan Secara relatif dpt mengidentifikasi keanekaragaman spesies pd tanah Beberapa spesies baru dpt dideteksi, dikarakterisasi hubungannya dg anggota genus yg lain, serta bentuk asosiasi dg tanaman inang

(Figure 1 Legend) Construction and analysis of metagenomic libraries from soil, hot spring outflow, deep ocean tube worms and sponge tissue using function-driven and sequence-driven approaches. This strategy was originally proposed by Pace et al. [3] and executed by Stein et al. [28]. (The photograph of non-phototrophic organisms flanked by phototrophs in hot spring outflow from the Porcelain Basin Area of the Norris Geyser Basin at Yellowstone National Park is reproduced with permission from CLE Fisher. Licensed for use, ASM Microbe Library linked to

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) merupakan salah satu teknik kultur independen berdasarkan pemisahan amplikon polymerase chain reaction (PCR) yang berukuran sama namun berbeda sekuen. PCR-DGGE biasanya diterapkan utk mengetahui struktur komunitas mikroba tanpa kultivasi, dan utk mempelajari dinamika komunitas sbg respon thd faktor-faktor lingkungan DGGE mrp metode yg dpt mendeteksi perbedaan potongan DNA yang berukuran sama namun berbeda sekuennya  potongan DNA dipisahkan dlm gel denaturing gradient berdasarkan perbedaan profil denaturasinya (melting)

Soil Community Analysis Using DGGE of 16S rDNA Polymerase Chain Reaction Products Denaturing gradient gel electrophoresis gel of Bacteria 16S rDNA polymerase chain reaction products (Bases 968 to 1406 relative to the E. coli rRNA sequence) amplified from USA (Lanes 1–4) and Norwegian (Lanes 5–6) soil-DNA extracts. Gel gradient ranging from 30 to 55% denaturant. Lane 1, no-till corn field; Lane 2, no-till soybean field; Lane 3, plowed corn field; Lane 4, plowed soybean field; Lane 5, fallow field; Lane 6, pastureland

Management of Soil Suppressiveness : - Crop rotation - Input system - Tillage and fertilization 2,4-DAPG-producing fluorescent pseudomonad  biological control

Penutup Aplikasi metode2 molekuler utk mempelajari mikrobiologi tanah telah menyediakan banyak informasi pd identifikasi mikroorganisme tanah dan kelimpahannya Teknik ini dpt memberikan dokumentasi yg lengkap dr status mo tanah sepanjang waktu Pengkajian cepat thd pengaruh praktek pengelolaan pd mo target

Penekanan seperti itu scr kritis untuk mengidentifikasi keefektifan strategi pengelolaan mo antagonis, jg dpt memberikan penjelasan yg tepat bagi kegagalan yg diharapkan utk mendorong jumlah dan aktivitas dr populasi tersebut