DNA Sequencing

DNA mRNA Protein Sekuen DNA membawa informasi Transcription Translation DNA mRNA Protein

Utas DNA A (adenine) komplementer dengan T (thymine) Ujung 5’ 2’-deoxyribose (sugar) Ujung 3’ C A C T T T A G A G C G Bases A (adenine) komplementer dengan T (thymine) C (cytosine) komplementer dengan G (guanine)

DNA utas ganda C G A T

“Sequencing” merupakan metode menentukan urutan basa nukleotida, adenin, guanin, citosin, timin pada sepotong DNA. Urutan nukleotida menentukan urutan asam amino, yang akhirnya menentukan struktur protein dan fungsinya. Perubahan sekuens DNA dapat mengakibatkan perubahan protein atau menyebabkan terbentuknya protein non fungsional Akibatnya dapat menimbulkan efek merugikan pada organisme

Terdapat dua teknik sequencing: Maxam & Gilbert, menggunakan chemical sequencing Sanger, menggunakan dideoxynucleotides. Sequencing yang modern menggunakan prinsip teknik Sanger. Metode Sanger menggunakan dideoxynucleotide triphosphates(ddNTPs) yang memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula ribosa. Yang normal memiliki OH pada deoxynucleotide triphosphates (dNTPs). Dideoxynucleotides merupakan penghenti rantai. Dalam reaksi sintesis jika dideoxynucleotide ditambahkan dan bukan normal deoxynucleotide, sintesis akan berhenti karena 3’OH yang diperlukan untuk penambahan nukleotida berikutnya tidak ada.

Deoxy vs dideoxy

DNA Sequencing A lot of modern DNA sequencing is based upon the following modified nucleotides. Metode Sanger dideoxy – ditemukan oleh Frederick Sanger memenangkan Nobel 1980

Sintesis DNA

Karena tidak ada –OH, replikasi berhenti

Metode Sanger memerlukan DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template Sejumlah nukeotida normal Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent)

Template DNA direplikasi melibatkan nukeotida normal tetapi secara random dideoxy (DD) nukleotida diambil (dipasangkan). Penambahan dideoxy nukeotida menyebabkan reaksi berhenti Hasilnya DNA dengan panjang yang bervariasi , masing-masing berhenti pada DDnukleotida tertentu yang dilabel. Karena tiap panjang yang berbeda bergerak dengan kecepatan yang berbeda selama elektroforesis, maka urutannya dapat ditentukan.

Dideoxy DNA Sequencing

DNA Sequencing Metode original dengan menggunakan radiolabeled DNA. Sejumlah kecil dideoxy nucleotides ditambahkan ke reaksi polymerase DNA.

DNA Sequencing 1.Terdapat lebih dari satu utas DNA dalam reaksi. 2. Tidak semua nukeotida adalah dideoxy.

DNA Sequencing 1.Terdapat lebih dari satu utas DNA dalam reaksi. 2. Tidak semua nukeotida adalah dideoxy. Sehingga multiple terminated products dihasilkan (tanda panah merah)

DNA Sequencing Digunakan fluorescently labeled dideoxy nucleotides (yang dapat digabungkan dalam satu tabung) dan dipisahkan dengan capillary electrophoresis dan dibaca dengan laser saat DNAs melewati jendela detektor. Komputer akan menghasilkan kromatogram seperti yang terlihat dibawah ini.

DNA sequencing Automated DNA sequencing – pada automated DNA sequencing, deoxynucleotide radioaktif tidak digunakan dan ke-4 reaksi dideoxy dikerjakan dalam satu tabung tunggal. Ini karena tiap ddNTPs dilabel dengan pewarna flourescent yang berbeda. Sehingga warna yang ada pada tiap fragmen yang disintesa korespon dengan warna yang berikatan pada dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk menghentikan sintesis fragmen. Isi dari satu tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur pada gel dan dielektroforesis.

DNA Sequencing Sebuah flourimeter dan komputer dihubungkan ke gel dan mendeteksi dan mencatat warna yang berikatan dengan fragmen saat mereka melewati gel. Urutan/sekuens ditentukan berdasarkan urutan warna yang keluar dari gel.

Capillary tubes Reagents Sample tray goes here Inside the sequencer

Sebuah print out hasil sequencing

Perbandingan sequence DNA sequence alignment – memasangkan dua DNA sequences untuk memaksimalkan kesamaannya 1. AACG dan AACG 2. AAGG dan AACG 3. AACGGTATGC dan ATCGGGTTGC AACG | | | | AAGG AACG | | | 1 mismatch AACG ATCG - G GT A TGC 2 gaps

Score: tiap pasangan yang sama posisinya: +2; tiap mismatch/ gap: -1 Best alignment – memasangkan dua sekuens dengan sesedikit mungkin jumlah mismatches dan gaps Score: tiap pasangan yang sama posisinya: +2; tiap mismatch/ gap: -1 AACG | | | | AAGG AACG | | | AACG ATCG - G GT A TGC score = 8 score = 5 score = 16

Sequence-alignment programs BLAST: http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/