Isolasi dan Pemurnian Protein

Tujuan Mempelajari fungsi enzim/protein Menentukan urutan asam amino Mempelajari struktur

Sel mengandung ribuan protein Prosedur pemurnian harus membedakan protein yang diinginkan dari protein yang lain Sifat protein merupakan kunci dalam merancang protokol pemurnian

Sifat Protein Muatan disebabkan oleh rantai samping COO- dan NH3+ Berat molekul protein bervariasi Titik isoelektrik, pI, pH ketika muatan total protein nol Jika protein dengan pI tertentu berada dalam larutan dengan pH tertentu, maka pH < pI < pH Net+ Net-

Prosedur pemurnian protein dapat dilakukan karena adanya variasi: Kelarutan, ukuran, muatan, binding specificity (affinity),sifat hidrofobik/hidrofilik

Sel Lisis Sentrifugasi Pelet Supernatan Protein terlarut Osmosis Freeze/Thaw French press Grinding glass beads Sonication (bakteri) Sentrifugasi Pelet Supernatan Debris sel Protein terlarut Isolasi Protein

Inhibitor Protease: inaktivasi protease yang dibebaskan selama lisis sel Nama Jenis Inhibitor Target Protease PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) Ireversibel Ser (+Cys) protease: terikat pada pusat aktif Ser/Cys Benzamidine Reversibel Ser dan Cys protease: inhibitor kompetitif EDTA Metalo enzim: chelate metals Pestatin (pentapeptida + gugus organik) Asp’acidic’ protease: inhibitor kompetitif (target: pepsin, HIV protease) Aprotinin (58-mer peptida) Serin protease, esterase: inhibitor kompetitif (target: tripsin, kimotripsin, plasmin) Leupeptin (Ac-leu-leu-Arg)

Stabilisasi: Ketika berada diluar lingkungan aslinya (native), protein menjadi kurang stabil. Meskipun organisme hidup pada temperatur 37oC, pemurnian dilakukan pada temperatur 4oC

Solubility (Salting Out) Garam berkompetisi dengan air Protein mengalami agregasi melalui interaksi van der Waals dan hidrofobik dan mengendap dalam bentuk native 1-4 M (NH4)2SO4

Strategi Pemurnian Muatan: Kromatografi Penukar Ion Kepolaran: Kromatografi Interaksi Hidrofobik Ukuran: Dialisis, Ultrafiltrasi, Gel elektroforesis, Kromatografi Filtrasi Gel, Ultrasentrifugasi Spesifisitas: Kromatografi afinitas

Ion-exchange Chromatography (IEX) Cation exchangers contain negatively charged polymer Anion exchangers contain positively charged polymer. Is effected by pH

Gel Filtration/Size Exclusion Chromatography

Kromatografi Interaksi Hidrofobik Protein mempunyai ‘daerah’ hidrofobik dipermukaan yang dapat berinteraksi dengan resin Resin yang mengandung gugus fenil atau alifatik mengikat protein: protein yang paling hidrofobik akan terikat paling kuat Elusi dilakukan dengan pelarut yang kurang polar atau dengan menurunkan [garam]

Schematic of HisLink and His-tag Interaction Two site are available for His-tag binding are rapidly coordinated with histidine in the presence of a His-tagged polypeptide

Aktivitas Vs. Aktivitas Spesifik

Elektroforesis SDS-PAGE Pemisahan protein (molekul bermuatan berdasarkan ukuran dalam medan listrik Protein didenaturasi dengan detergen anion

Penentuan Massa Molekul Protein

Analisa Tingkat Kemurnian dengan SDS-PAGE Ekstrak kasar Pengendapan dengan garam Kromatografi penukar ion Kromatografi filtrasi gel Kromatografi afinitas 10μg protein/lajur