Uji Kontaminan Mikroba dalam Pangan Sudrajat FMIPA UNMUL SAMARINDA TAHUN 2010 Bahan Diskusi pelatihan Pegawai BPOM Samarinda, Tahun 2010

Mikrobia pada bahan makanan Terdiri dari berbagai spesies yang berasal dari berbagai lingkungan Populasinya tergantung dari penerapan proses sanitasi, proses pengolahan dan kontrol yang digunakan untuk membunuh mikrobia (metoda preservasi)

Tujuan melakukan analisa mikrobiologi Menentukan jenis dan sumber kontaminan Evaluasi proses sanitasi, penanganan bahan dasar dan proses pengolahan Menentukan kualitas mikrobiologis makanan Menentukan umur simpan makanan

Microorganisms in food (food-borne microorganisms) Beneficial/ desirable e.g. Lactic acid bacteria in fermented food Deteriorated/ undesirable Pathogenic or Toxigenic Non-pathogenic Spoilage m.o. but can cause diseases e.g. Bacillus sp.in milk Indicator of pathogens e.g. Escherichia coli Food can be a vehicle of pathogens to human 4

Sistem Pengawasan Makanan Oleh BPOM-RI Pemberian Nomer Registrasi BPOM-RI - Makanan/Minuman : MD (dalam), ML (import) 12 digits - Obat-obatan : D (dalam), DL (obat import) - Kosmetika : CD (dalam), CL (kosmetik import) - Alat kesehatan : KD (dalam), KL (alat import) - Obat tradisional : TR Melakukan uji laboratorium sampel makanan - Uji kandungan (komposisi) gizi - Uji fisika kimia - Uji mikrobiologi - Uji bahan berbahaya dan beracun

Sources of bacterial contamination Staff, customers P PEOPLE Vegetables, meat, shellfish, water R RAW FOOD Soil, dust E ENVIRONMENT Insects, rodents, animals, birds P PESTS

7

8

Food-borne pathogens Bacteria Salmonella spp. Shigella spp. Staphylococcus aureus Enteropathogenic E. coli Clostridium botulinum, Cl. perfringens Vibrio cholerae, V. parahaemolyticus Bacillus cereus Campylobacter jejuni Yersinia enterocolitica

Food borne pathogens Fungi Parasites produce mycotoxins Aspergillus sp. Penicillium sp. Fusarium sp. Toxocara canis Amoebae

Food-borne diseases Food poisoning Other diseases Pathogen’s cells Toxin Botulism: Clostidium botulinum Campylobacteriosis: Campylobacter jejuni E. coli infection: E. coli O157:H7 Salmonellosis: Salmonellae Shigellosis: Shigellae Other diseases caused by viruses: Hepatitis A, poliomyelitis, etc. 11

Food poisoning Symptoms Diagnosis abdominal cramps nausea vomiting diarrhoea fever dehydration Diagnosis examination of the faeces and suspected food samples

Testing Methods Total heterotrophic plate count Growth on detection media Most Probable Number Culture-dependent techniques Sample with Bugs Culture-independent techniques Optical Nucleic Acid-Based Immunological Methods Chemical

Kriteria mikrobiologis makanan Standard – bagian dari regulasi Spesifikasi – untuk spesifikasi purchasing Guideline – digunakan untuk monitoring proses atau sistem

Pengenalan alat-alat laboratorium mikrobiologi 1. Peralatan sterilisasi  a. Sterilisasi kering : alat gelas, cawan Petri, pipet. Alat yang digunakan berupa oven yang suhunya dapat mencapai 180 oC. b. Sterilisasi basah : untuk sterilisasi media, larutan, kapas, lap, dsb. Peralatan yang umum digunakan adalah autoklaf.   c. Sterilisasi saring. untuk sterilisasi cairan yang rusak bila kena panas (misal larutan vitamin)  2. Alat menghitung koloni Quebec Colony Counter 3. Laminar flow (untuk memindahkan mikrobia secara aseptis) 4. Spektrofotometer : untuk mengukur kekeruhan yaitu dengan cara mengukur sinar yang lewat pada media cair  mengukur konsentrasi mikrobia pada media cair.  5. Mikroskop

Ketrampilan dasar Persiapan/pembuatan media Sterilisasi dan penanganan/pembuangan limbah Metoda aseptik (aseptic transfer – untuk memindahkan kultur) Penyimpanan mikrobia Kultur dalam agar miring Deep freeze (dg cryoprotectant) Liofilisasi (dalam ampul)

Sterilisasi Sterilisasi – basah, kering, filtrasi Sterilisasi basah / uap panas kombinasi suhu, tekanan dan waktu (121C, 15 mnt, 15 lbs/square inch) Sterilisasi kering untuk alat-alat gelas Sterilisasi dengan uap panas dilakukan pada media yang akan digunakan baik sebelum dan sesudah inokulasi dengan mikrobia

Metode aseptis dan teknik isolasi Kultur murni: apabila kultur ini hanya terdiri dari satu spesies mikrobia saja. Jika spesies mikrobia yang lain secara tidak sengaja masuk ke dalam kultur murni, kultur tersebut dikatakan telah terkontaminasi, dan tidak lagi dikatakan sebagai kultur murni tetapi kultur campuran.

Isolasi dengan cara goresan Hasil goresan yang baik Cawan - terkontaminasi Goresan yang berasal dari dua jenis bakteri Cara goresan yang salah Koloni kurang terpisah

Koloni bakteri : Morfologi (bentuk dan struktur) Bentuk dan ukuran koloni : irreguler Margin/edge : undulate/wavy Elevataion : umbonate Warna : putih Tekstur : dry (rough)

Metoda Kuantitaif Enumerasi atau estimasi langsung atau tidak langsung Aerobic Plate Counts (standard plate counts untuk dairy products), anaerobic counts, psychrotrophic counts, thermoduric counts, coliform counts, S. aureus counts, yeast and mold counts.

Enumerasi langsung Microscopic Counts CFU – Colony Forming Unit Nonselective agar media (PCA) Nonselective differential agar media Selective agar media Selective differential agar media

Enumerasi tidak langsung MPN Dye reduction test Pengenceran - nonselective media cair – jarang digunakan

Metoda Kualitatif Bakteri patogen (positif atau negatif) Salmonella, E. coli O157:H7, Clostridium botulinum, Listeria dll

Metoda Cepat ELISA Nucleic Acid Probe

Deteksi mikrobia pada makanan Total mikrobia (bakteri, yeast, jamur/mold) Bakteri indikator Coliform, fecal coliform, E. coli, Grup Enterobacteriacea Enterococci Bakteri pathogen Classical pathogen (Salmonella, Shigella, EPEC E. coli Emerging pathogen (Vibrio, Listeria monocytogenes, Yersinia, Campylobacter jejuni, dll) Kriteria bakteri indikator dan pathogen Berkaitan dengan feses dan pathogen enterik Level/rasio eksistensinya pada feses, bakteri indikator dan enterik Resistensinya terhadap lingkungan (habitat) alami (feses dan makanan) Resistensinya terhadap berbagai kondisi (proses dan penyimpanan makanan) Waktu yang dibutuhkan untuk deteksi

Penghitungan mikrobia dalam bahan pangan Uji coliform dengan MPN Pencemaran air mengapa coliform ? Pengujian : Uji pendugaan (presumptive tests) Uji penetapan (confirmation tests) Uji lengkap (completed tests)

Uji mikrobiologi pada bahan makanan 7 Total mikrobia (bakteri, jamur, yeast) 6 Plate Count 5 4 3 2 Bakteri indikator : Coliform/E.coli 1 MPN -1 Bakteri patogen -2 Media resusitasi -3 Media diperkaya -4 Media selektif -5 Isolasi dan identifikasi -6 Log jumlah sel

Ada beberapa variasi pada enumerasi dengan cara ini, yaitu : 1.Pour plates 2.Spread plates

Dilution and Plate Count (1)

Dilution and Plate Count (2)

Prosedur Sampling Gunakan wadah yang steril Jaga tangan selalu bersih dan kering Jangan membalik atau menjatuhkan tutup botol Jangan memasukkan plastik sampel yang belum steril kedalam saku baju Jangan mengkontaminasi bagian atas ataupun bagian dalam plastik sampel. Cuci peralatan sampling sebelum digunakan Isi didalam wadah tidak lebih dari 2/3 atau 3/4 –nya Jangan memegang wadah (belum tertutup) melewati permukaan sampel ketika sampel tersebut dipindahkan Dinginkan sampel pada suhu 0-4,4oC Pindahkan sampel dalam wadah untuk pengiriman ke laboratorium Setelah digunakan, kembalikan wadah sampel ke laboratorium untuk disterilkan kembali

Standard Plate Count (SPC) Standard di dalam equipment, material dan inkubasi Equipment – tempat kerja, kabinet, refrigerator, termometer, transfer pipet, botol untuk pengenceran, cawan Petri, timbangan, waterbath, autoclave, inkubator, dll Penyimpanan sampel suhu 4,4 C, waktu pengujian < 36 jam Media – Standard method agar (Plate count Agar) Pancreatic digest of casein (tripton) 5,0 g Yeast extract 2,5 g Glucose 1,0 g Agar 15,0 g DW s/d 1 liter pH (setelah sterilisasi) 7.0 + 0,2 Inkubasi 32 + 1C, 48 + 3 jam untuk mesofilik Untuk termofilik : 55 + 1 C selama 48 jam, sebagai TBC/ml atau g Untuk psikrofilik : 7 + 1 C selama 10 hari, sebagai PBC/ml atau g

Conventional techniques Standard plate count: SPC Homogenised food sample Dilutions Plate on suitable selective media Incubate at ….oC, for… h. Colony count Shelf-life analysis SPC = 106 CFU/ g or ml of product = spoilage or nearly spoilage

Conventional techniques Most probable number: MPN Growth in liquid medium Based on 3 decimal dilutions (5 or 3 tubes at each dilution) Number of positive (growth) tubes of each dilution Find the MPN values in Table reference Ex. Sample 1.0g, 0.1g, 0.01g=1,0,2 MPN/g = 11

Most probable number: MPN Selecting 3 dilutions for Table reference when more than 3 dilution are used, select only 3 dilutions according to 2 cases 1. One or more dilution show all tubes positive 2. No dilutions show all tubes positive Conversion of Table units Approximation of an unusual series of dilutions Confidence interval

Rapid tests Commercial kits: many Faster than conventional method e.g. the MMO-MUG method for coliform testing Negative Positive Negative Positive Total coliform E. coli

Molecular detection Method Has been used to detect Food-->liquid/ solid media--o/n(16-24 h)--->DNA extraction-->PCR---> Hybridisation with specific probe Has been used to detect enteroinvasive E. coli and Shigella spp., V. vulnificus Hepatitis A virus, and V. cholerae in foods PCR has been used to detect enteroinvasive E. coli and Shigella spp. (54), V. vulnificus (37) Hepatitis A virus (see Chapter 26), and V. cholerae

Molecular detection Hybridisation No direct detection from food Probe = DNA or RNA Probe design: specific genes such as probe labelling: radioactive, non-radioactive No direct detection from food Requires 105-106 copies of the target sequence to yield a clear, positive result Polymerase Chain Reaction (PCR)

Bakteri coliform Bentuk batang pendek, Gram negatif, aerob dan fakultatif anaerob, tidak membentuk spora dapat menfermentasi laktosa & menghasilkan gas pada suhu 32 C selama 48 jam Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter, Erwinia Bakteri indikator- berasosiasi dengan jalur intestin, keberadaannya dalam makanan – merupakan kontaminasi dari jalur intestin (feses) Uji coliform – terjadinya (re)kontaminasi & evaluasi proses sanitasi, baik pada proses pemerahan susu, setelah pasteurisasi, penyimpanan, dan proses-proses berikutnya

Presumptive test – Positive Koloni berwarna merah gelap, diameter 0,5 mm muncul setelah 24 + 2 jam inkubasi suhu 32 C pada media VRBA (violet red bile agar) Pada media 2% brilliant green lactose bile broth (BGLB) terbentuk gas setelah fermentasi 48 + 3 jam pada suhu 32 C Complete test – Positive Pada Eosin Metilen Blue (EMB) agar, 32 C, 24 jam – koloni berwarna hijau metalik Pada laktosa cair, 32 C, 48 jam – memproduksi asam dan gas Pada nutrien agar, 32 C, 24 jam - Gram negatif, batang pendek, dan tidak membentuk spora

Coliform test – pada media padat Media yang digunakan VRBA (Violet red bile agar) 1 ml sampel (atau diencerkan terlebih dahulu) dimasukkan ke dalam cawan dan ditambah 10-15 ml media yang masih mencair (atau 4 ml sampel ditambah 15-20 ml media), tergantung dari perkiraan populasi coliform Dilapisi lagi dengan media VRBA untuk mencegah pertumbuhan koloni di permukaan Inkubasi (posisi terbalik) selama 24 + 2 jam pada 32 C Koloni coliform berwarna merah gelap diameter 0,5 mm

Pemeriksaan bakteriologis meliputi : penghitungan TPC, penghitungan MPN dan Identifikasi E.coli dan penentuan Strain E.coli O157:H7 Metode pemeriksaan bakteriologi dilakukan secara: Kualitatif: - presumptive test - comfirmed test - completed test b. Kuantitatif: Total Plate Count (TPC) MPN (Most Probable Number): yaitu perkiraan jumlah kuman yang mendekati per ml /gram

A.Cara pengambilan sampel: Persiapkan wadah steril Siapkan formulir tentang lokasi pengambilan, tanggal pengambilan dan kode sampel Masukkan sampel ke dalam wadah steril tersebut Wadah diberi kode, lokasi sampling dan tanggal pengambilan sampel dengan menggunakan spidol tahan air Masukkan ke dalam box es yang telah disiapkan sebelumnya Kirim sampel ke laboratorium untuk diperiksa 45

B. CARA KERJA DI LABORATORIUM : (1).Persiapan sampel mikroba. Masing-masing sampel ditimbang 10 gram dimasukkan ke dalam gelas ukur, kemudian ditambahkan larutan buffer phosphat pH.7.0 hingga mencapai volume 100 ml, kemudian dikocok sampai homogen . Dengan menggunakan pipet steril, pindahkan 1 ml suspensi di atas ke dalam larutan buffer Phosfat Lakukan pengenceran sampai di dapat (pengenceran 10-1) , kemudian sebanyak 1 ml dari tiap pengenceran tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam 9 ml buffer phosphat (pengenceran 10-2), demikian seterusnya sampai pengenceran yang diinginkan.

47

48

2). Penentuan Nilai TPC Bacteria dengan Pour Plate Methods ( Metode Tuang) Metode ini bertujuan menghitung nilai Total Plate Count Bacteria /TPC ( Angka Lempeng Total/ALT) suatu bahan Prinsif : pertumbuhan bakteri pada media setelah diinkubasikan pada suhu 37 o C selama 2 x 24 jam Nilai TPC ditentukan dengan cara menanam tiap contoh : a. 1 ml contoh bahan dan b. 1 ml contoh bahan dengan penipisan 1 : 101 , 10 2 dan 1 : 103 masing- masing pada lempeng nutrient secara pour plate . Hasil pertumbuhan koloni dihitung dengan quibec coloni counter dan dinyatakan dalam jumlah kuman per ml bahan.

Masing-masing pengenceran diambil 1 ml diinokulasikan pada media Nutrient Agar dengan sistem tuang, Kemudian diinkubasikan pada suhu 370 C selama 24-48 jam. Koloni yang tumbuh dihitung sebagai Total Plate Count (TPC). - Dari pengenceran 10-1, diambil 0,1 ml diinokulasikan pada media Mac Conkey agar untuk pengujian E.coli.

54

3).Konfirmasi untuk Coliform dan F. Sampel dari setiap pengenceran (10-1, 10-2,10-3) diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 3 tabung yang berisi lactose broth dan Brilliant Green Bile (BGB) 2%. Broth diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370C. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya gas pada tabung tersebut dan selanjutnya dihitung

4). PEMBIAKAN SAMPEL (1).Nutrien Agar (2).SS Agar (3).Mac Conkey Agar Dari tiap pengenceran di atas diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam petridish Tuangkan sebanyak 15-20 ml nutrien agar ke dalam petridish tersebut di atas Goyangkan cawa petridish sedemikian rupa sehingga sampel dan agar tercampur merata Setelah agar membeku, balikkan cawa petridish dan inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Hitung koloni yang tumbuh 56

(2). SS Agar Ambil satu sengkelit sampel dari pengenceran di atas dan goreskan pada permukaan media SS Agar secara zigzag Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Amati koloni yang tumbuh Bila ditemukan koloni tidak berwarna/ bening, maka koloni tersebut tersangka sebagai Salmonella 57

(3). Mac Concey Agar Ambil satu sengkelit sampel dari pengenceran di atas dan goreskan pada permukaan media MC Agar secara zigzag Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam Amati koloni yang tumbuh Bila ditemukan koloni berwarna merah jambu, bulat dan besar, maka koloni tersebut tersangka sebagai E.coli 58

B. Metode MPN (Most Probably Number) Penentuan MPN presumptive coliform - Pada pemeriksaan ini dipakai laktosa broth - Siapkan 7 tabung reaksi yang berisi LB sebanyak 10 ml - Pipet sampel 10 ml, lalu masukkan ke dalam tabung 1-5 - Pipet sampel 1 ml, lalu masukkan ke tabung 6 - Pipet sampel 0,1 ml, lalu masukkan ke dalam tabung 7 - masing-masing tabung dihomogenkan - Inkubasikan pada suhu 37o selama 2 x 24 jam - Hasil (+) dinyatakan dengan terbentuknya gas pada tabung durham dan dilanjutkan dengan tes penegasan - Hasil (-) berarti coliform negatif dan tidak perlu dilakukan tes penegasan

Prosedur pengujian total coliform dengan metode MPN (FDA, 1995)

2. Test Penegasan Dari tiap tabung yang positif pada test awal, dipindahkan 1-2 ose ke dalam tabung yang berisi 10 ml BGLB 2 %. Dari masing-masing tabung penegasan diinokulasikan ke dalam dua seri Satu seri tabung BGLB 2 % diinkubasikan pada suhu 37o C selama 24 jam untuk coliform. Satu seri tabung BGLB lainnya diinkubasikan pada suhu 44 o C selama 24 jam untuk colifecal Pembacaan dilakukan setelah 24- 48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB yang menunjukkan (+) gas. - Kemudian dicocokkan dengan tabel MPN Hoskin J.K dan hasilnya dinyatakan dalam faecal coliform /gr sampel.

Tabung positif : 5 4 1

63

Lihat tabung gas positif (asam dan gas ; harus ada keduanya), lalu hitung tabung positif untuk tiap seri. Tulis kombinasi tabung positif tiap seri (misal : 3 2 1). Kombinasi angka tersebut lalu dicocokkan dengan tabel MPN untuk seri 3 sehingga diperoleh jumlah mikroba sebenarnya. Misalkan . Diperoleh kombinasi jumlah tabung positif : 321 maka jumlah bakteri coliform adalah 150 sel/100 ml. 64