Presentasi Enzimologi CYCLOOXYGENASE Assalamualaikum wr wb. Selamat sore semuanya. Pada kesempatan kali ini saya akan mempresentasikan mengenai salah satu enzim yang berperan pada biosintesis lemak yaitu cyclooxygenase. Sofi Siti Shofiyah (20510038)

Agenda Presentasi Pendahuluan Isolasi dan Pemurnian Struktur Mekanisme Reaksi Regulasi dan inhibisi Adapun agenda presentasi saya kali ini akan diawali dengan pendahuluan mengenai enzim cyclooxegenase, seperti persamaan reaksi enzim ini dan juga tata namanya, selanjutnya saya akan membahas mengenai struktur dari enzim ini serta mekanisme reaksi yang terjadi pada enzim ini. Inhibisi akan dibahas mengenai jenis inhibisi yang terjadi serta zat-zat apa yang dapat digunakan sebagai inhibitor. Isolasi dan pemurnian enzim ini akan dibahas mengenai enzim dari …… Dan terakhir adalah kesimpulan. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Pendahuluan Kita kadang sering merasa pusing atau nyeri tak tertahankan. Hal ini karena adanya zat prostaglandin yang bekerja sebagai mediator untuk berbagai efek psikologi tersebut. Prostaglandin ini disintesis dari arachidonic acid (asam arichidonoat) menjadi prostaglandin oleh enzim cyclooxygenase. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Cyclooxygenase (COX) Clycooxygenase adalah enzim yang mengkatalis perubahan arachidonic acid menjadi prostaglandin. Enzim ini merupakan enzim bifugnsional karena memiliki dua aktivitas katalitik, yaitu sebagai cyclooxygenase, yaitu dengan menambahkan dua molekul oksigen dan sebagai peroxidase, mereduksi gugus karboksilat menjadi alkohol. PGH2 nantinya akan segera di ubah ke one of several prostanoids. arachidonic acid (AA) to yield prostaglandin G2 (PGG2), containing both a 9–11 endoperoxide and a 15-peroxide group; and a peroxidase reaction, which converts PGG2 to prostaglandin H2 (PGH2) where the 15-peroxide is reduced to an alcohol Apa itu postaglandin G2 dan H2?..... Apa itu senyawa eicosanoid? Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Kelas Enzim Cyclooxygenase Nama lain: Prostaglandin H2 Synthase (PGHS), Prostaglandin endoperoxide synthases (PES) EC. 1. 14. 99. 1 PGHS adalah integral membran protein yang terletak terutamanya di retikulum endosparma EC 1.-.-.- Oksidoreduktase EC 1.14.-.- Bekerja pada pasangan donor dan dengan menggambungkan atau mengurangkan molekul. EC 1.14.99.- bermacam-macam EC 1.14.99.1 Prostaglandin-endoperoxide synthase (Cycloxygenase) Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Jenis Enzim Cyclooxygenase Jenis Cylcooxygenase: COX COX-1 COX-2 Cyclooxygenase merupakan integral membran protein yang terletak di retikuum endosparma Bentuk Cyclooxygenase (Isoenzymes) - berbeda pada sistem regulasi ekspresi dan distribusi jaringannya. Di tahun 1990 peneliti menemukan terdapat dua jenis bentuk enzim COX, yaitu COX 1 dan COX 2. COX 1 banyak terdapat di setiap jaringan. COX-1 dihasilkan secara kontinu bekerja didalam mucosa lining untuk memgatur normal lining di perut, ginjal, dan usus. COX2 bersifat inducable hadir karena adanya induksi akibat peradangan yang berasoiasi dengan citokin, mitogen, endotoxin pada sel yang meradang. Inhibisi pada enzim ini dapat menghilangkan rasa sakit yang kita rasakan, namun akan mengurangi kemampuan tubuh untuk memproduksi prostaglandin. Isoenzymes adalah one of variuos structurally retal forms of an ezymes yang memiliki mekanisme sama tapi berbesa chemical, physical, dan immunological characteristics. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Isolasi dan Pemurnian Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Metode Isolasi dan Pemurnian Sheep vesicular glands Isolasi Supernatan 54 % (NH4)2SO4 DEAE Cellulose Pemurnian Flurbiprofen-Sepharose Isoelectric Focusing Sephadex G-200 Enzim Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Uji Karakteristik Enzim SDS Page Absorption Spectra Aktivitas Enzim AAS Absorpsi spectra untuk ….. Aktivitas enzim itu adalah …. Aas untuk mengetahui …. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

SDS Page 1 2 3 4 Keterangan : 1 : 54% (NH4)2SO4 2: DEAE -cellulose 1 2 3 4 Keterangan : 1 : 54% (NH4)2SO4 2: DEAE -cellulose 3: Flurbiprofen-Sepharose 4: isoelectric focusing-Sephadex G-200 Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Struktur cyclooxygenase Struktur dari enzim ini telah diketahui sejak tahun 1994 dan 196 Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Struktur Cyclooxygease Stuktur COX1  1994 oleh Daniel Picot 576 asam amino Berat molekul 70kDa Sturktur COX2 1996 oleh Ravi G Kurumbail 607 asam amino Berat molekul 72 kDa Struktur cyclooxygenase telah diketahui sejak tahun 1994 sedangkan cox2 pada tahun 1996. COX 2 dan COX1 memiliki homology seqeunce sekitar 60% tetapi pada sisi aktif dari cyclooxegane memiliki homologi sequence hampir 87% Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Struktur Dimer COX 1 Enzim COX berada dalam bentuk homodimer yang menempel pada luminal side dari inti dan retikulum endoplasma. Residu 1-24 merupakan signal sequence dari enzim COX sedangkan 25-600 mature ovine PGH1. terdiri dari hampir 40% terdiri dari alfa helix Bisa teman2 lihat disana yang berbentuk silinder itu adalah alfa helix sedangkan yang berbentuk pipih adalah beta sheet. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Struktur COX1 Struktur dari COX ini memiliki tiga domain, yaitu EGF (epidermal growth factor module), membran binding domain, dan catalityc domain. Domain EGF modul bisa dilihat berwarna hijau. Terdiri dari residu ke-34 hingga 72 yang membentuk domain yang kompak karena ada tiga ikatan sulfida di dalamnya. (yang garis kuning). Dan digabungkan dengan tubuh utama enzim yang warna biru dengan jembatan sulfida. Membrane binding domain ada pada residu 73-116 tediri dari alfa helix a, b, c, dan d. domain ini merupakan domain yang berikatan dengan membran. Helix ini membentuk motif baru untuk dapat insersi ke lapisan bilayer lipid. Katalitik site berada pada residu ke 117-587. strukturnya berupa globular. Pada katalitik site ini memiliki dua aktif site, yaitu cox dan pox site. Dan pada sisi aktif pox terdapat senyawa haem sebagai satu-satu gugus prostetik. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Catalytic Domain Katalitik site itu ada 2 bagian lobe, yatu large lobe dan small lobe. Larger lobe membentuk ukuran Vyang dibentuk oleh helix 5, 6 dan menggegam H2 seperti jembatan, sedangakan 3, 10, 18, 19 membentuk lobe yang berhasil sebgai pembatas lobe besar. Lobe kecil disusun oleh heis 1, 8. 12, 14,15,16, Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Sisi Aktif Peroksidase Sisi aktif peroksidase memiliki dua fungsi yaitu sebgai pereduksi PGG2 menjadi PGH2 serta mengaktifasi reaksi cyclooxegenase. Aktifitas pada sisi kataliti ini adalah haem dependent periroxidase. Letak sisi aktif dari enzim ini adalah di permukaan large lobe dan small lobe. Pada sisi aktif yang menjadi residu penting adalah histidin 207, serta Glisin 203. Histidin dan glisin ini terletak berhadapan dengan haem. Residu ini akan membentuk konformasi yang pas sehingga proses katalitik peroksidse berjalan effisein, Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Sisi Akif Cyclooxygenase Active site of cyclooxygenase berada di dalam dan celah sempit yang terbentuk dari helix a,b,c. residu residu yang berperan adalah tirosin pada posisi 385. posisi ini dekat dengan pengikatan haem yang nantinya akan berkaitan dengan mekasnisme reaksi yang terjadi. Selanjtunya adalah ser 530, residu ini akan mengalami acetilasi jika beriktana dengan inhibitor seperti aspirin, pengikatan pada serin akan mengakibatkan interkasi juga dengan arg 120 Adanya inhibisi oleh flubirprofen pada serin 530 Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Perbedaan Stuktur COX -1 dan COX-2 Signal peptide COX-1 lebih panjang 7 residu Memiliki celah katalitik cyclooxygenase yang lebih lebar dibandingkan dengan COX-1 Posisi isoleusin ini mengakibatkan kerusakan sturktur lokal tetapi tidak terlalu parah Memiliki celah yang lebih besar dikarenakan,, Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Mekanisme reaksi Mekanisme rekasi enzim COX ini bukan merupakan non linear stady state kinetik. Melainkan mekanismenya melibatkan reaksi radikal. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Mekanisme Reaksi Peroksidase Awalnya haem yang mengandung fe 3+ akan mengalami oksidasi menjadi fe 4 plus sedangkan pgg2 menjadi pgh2 mengalami reduksi. Oksidasi pada haem akan membentuk senyawa inetermediate pertama, yaitu fe 4+ dan radikal porphyrin. Selanjutnya terjadi intra molecula elctron trasfer di ke senyawa ii, membentuk tiosin yang radikal. Intermediate II dan compuand dua adalah senyawa yagn tidak dapat dibedakan. Current PGHS peroxidase mechanism. The generally accepted mechanism [33] is a hybrid of the mechanisms of horseradish peroxidase and cytochrome c peroxidase. The formal oxidation state of the heme iron is indicated. ROOH and ROH, hydroperoxide and corresponding alcohol; PPIX and PPIX+, protoporphyrin IX and its cation radical; e-, reducing equivalent from peroxidase cosubstrate; Y, tyrosyl radical. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

The ‘‘branched-chain” reaction Peroksidase tidak hanya memiliki ktifitas sebagai katalitik saja tetapi sebagai pengaktif reaksi cyclooxeganse. Bagaiman hal ini dapat terjadi. Dari mekanisme sebelumnya akan dihasilakn tirosn yang radik. Tirosin ini sebagai penyerang subtrat sehingga dihasilkan PGG2. Model mekanisme yang disarankan analogy to receptor-mediated signal transduction can be made, Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Mekanisme Radikal Bebas Mekanisme radikal yang disaranak untuk reaski cyclooxegenase adalah sebgai berikut. Tirosin mengambil h pada c13, sehingga terbentuk pentadienil radikal c11-c15. oksien akan diserang oleh arachidonic acid yang radikal membentuk sklisalai 9.11 dioxibridge, menhasilkan karbon radikal pada posisi 8. Terjadi sikilisasi den mengakibatkan radikla menjadi pada c15 dan menyerang kembali oksigen, kemudian radikal pada oksigen di karbon 15 akan berpindah ke tirosin dan dihasilkan lah pgg2. Yang nantinya pgg2 ini masuk ke siklus pox. Fig. 15. Hypothetical mechanism for cyclooxygenase catalysis, modified from the original proposal by Hamberg and Samuelson [80] to include the role of the Tyr385 radical (Y) in generation of the first AA radical intermediate (AA) and to reflect the possible reversibility of the initial steps (blue arrows). Anaerobic conditions block at step 2. Review Prostaglandin H synthase: Resolved and unresolved mechanistic issues Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Regulasi dan inhibisi Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Sistem Regulasi di dalam tubuh Tanskripsi COX-2 diinduksi dengan cepat sebagai respon dari berlebihnya darah (plethora) pada organ Kestabilan mRNA COX-2 and efisiensi translasi diatur oleh berbagai elemen pengatur microRNAs dan RNA-binding proteins yang spesifik mempengaruhi kestabilan m-RNA COX-2 Regulasi COX-2 lainnya adalah alternatif polyadenilasi. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Inhibisi pada Enzim COX Enzim ini dapat diinhibis oelh NSAID nnsteroidial antiinflammatori drugs. Obat ini menghinbihisi baik enzim COX 1 dan COX2, ehingga prostaglandin tidak dihasilkanternyata inhibisi ini sangat efektif untuk menghampat pembentukan prostaglansndin tetapi tubuh akan kekurangan prostaglandi yang mengyebaban efek samping dari obat, yaitu sakit pencernaan, gijal, usus. Salah satu obat yang dikenal adalah aspirin. Oleh karena itu akan dibuat obat yang hanya spesifik untuk COX 2saja karena COX2 yang menyebabkan produksi prostaglandin jika ada peradangan. NSAIDs Inhibit COX Nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), commonly prescribed to treat arthritis, work by inhibiting prostaglandins. Traditional NSAIDs (ibuprofen, naproxen), however, can cause gastrointestinal problems including ulcers. Traditional NSAIDs are considered "nonselective" because they inhibit both COX-1 and COX-2. The inhibition of COX-2 by traditional NSAIDs accounts for the anti-inflammatory effect of the drugs while the inhibition of COX-1 can lead to NSAID toxicity and associated side effects (ulcers, prolonged bleedng time, kidney problems). COX-2 Selective NSAIDs In the late 1990s, the first COX-2 selective NSAID (Celebrex) was developed, and others soon followed. Theoretically, drugs which were developed as COX-2 selective inhibitors -- Celebrex, Vioxx, and Bextra -- should have been preferred over traditional NSAIDs. Vioxx and Bextra have since been removed from the market, and Celebrex remains the only available COX-2 inhibitor available in the United States. Since the withdrawal of Vioxx, due to an increased risk of heart attack and stroke, the FDA scrutinized the entire class of drugs (all NSAIDs and COX-2 inhibitors, sold over-the-counter or by prescription only) and added warnings to the prescribing instructions. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Klasifikasi Inhibitor pada COX Irreversible inhibition contoh: Aspirin Reversible inhibition contoh: ibuprofen Slow, Time-dependent inhibition contoh: flurbiprofen Selectively inhibition COX2 contoh: SC-558 Ad berbagai jenis obat yang digunakan untuk inhibisi enzim ini sehingga mengakibatkan enzim ini memiliki berbagai jeni klasifikasi inhibitor Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

COX 1 dan COX 2 saat mengikat SC-558 Yang oren adalah COX 1 sn yang ungun COX2. dilihat struktur pengikatannya dengan SC 558 . Yang oren tidak mampu mengikta SC 558 karena besar. Sedangkan pada posisi 523 itu dibentuk valin, Isoleusine 523 Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Kesimpulan COX adalah bifungsional enzim Memiliki dua sisi aktif, yaitu sisi aktif cyclooxygenase dan sisi aktif peroxidase. Mekanisme reaksi terjadi disebut branched chain radikal mechanism Regulasi COX-2 terjadi ditingkat transkripsi dan post-transkripsi. Inhibisi enzim dilakukan oleh senyawa -senyawa NSAIDs Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

Daftar Pustaka Kurumabail, R.G., Structural basis for selective inhibition of Cyclooxygenase -2n by anti inflammantory agent, Nature(1996) volume 384 Picot, The X-ray cristal structure of the membran protein prostaglandin H2 synthase-1. Nature (1994) vol 347, 1994 Ah-Lim Tsai, Prostaglandin H synthase: Resolved and unresolved mechanistic issues, Archives of Biochemistry and Biophysics, 493 (2010) 103–124. Harper, Complexity of COX-2 gene regulation, Biochem. Soc. Trans. (2008) 36, 543–545. Hemler, Martin, Purification of The Cyclooxygenase That Forms Prostaglandins, The Journal of Biological Chemistry (1976), 5576-5579. Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase

TERIMA KASIH Presentasi Enzimologi: Cyclooxygenase