IMMUNOHEMATOLOGI Dr HERU SETIAWAN

IMUNOHEMATOLOGI Cabang Ilmu Patologi Klinik yg mempelajari penggunaan teknik imunologik untuk mendeteksi kelainan-kelainan hematologik, al: 1. Reaksi transfusi hemolitik 2. Reaksi hemolitik pd bayi yang baru lahir (HDN=Hemolytic Disease of the Newborn) 3. Reaksi hemolitik pd AIHA (Auto Immuno Hemolytic Anemia)

Pemeriksaan laboratorium yg sering dilakukan untuk kepentingan klinis adalah : 1. Deteksi Antigen (Ag) gol darah ABO & Rhesus (Rh) 2. Tes pretransfusi : Cross matching test reaksi silang Mayor & Minor 3. Deteksi antibodi (Ab) Coomb’s test (Test Anti Globulin)

Reaksi transfusi hemolitik HDN AIHA Coomb’s test Gol drh ABO Gol drh Rh Reaksi silang

Pendahuluan Normal: Abnormal: hemolisis mengalami hemolisis Jutaan eritrosit diproduksi tiap menit, umur 120 hari Eritrosit tua, ‘mati’: dibersihkan dan dihancurkan oleh SRE (limpa) Penyebab hemolisis: sebagian besar krn adanya antibodi Tipe hemolisis : destruksi/kerusakan imun Tjd pd reaksi transfusi, hemolytic disease of the newborn (HDN), autoimmune hemolytic disease (AIHA)

Dasar-dasar imunologi Pendahuluan >> reaksi transfusi hemolitik disebabkan krn kerja antibodi (dlm serum pasien) spesifik berinteraksi dg antigen donor Dasar-dasar imunologi

Dasar imunologi Pendahuluan Eritrosit mengekspresikan antigen (Ag) (glikoprotein) di permukaan sel eritrosit, Ag tsb disebut Aglutinogen Aglutinogen bersifat imunogenik Antigen A : golongan darah A Antigen B : golongan darah B Tidak mengekspresikan Ag A & B : gol O Normal seseorang membentuk aglutinin thd Antigen yg “ tidak dimiliki “ oleh eritrosit didlm tubuhnya sendiri Antibodi (Ab) dlm serum (Aglutinin): anti A, Anti B

Macam-macam antibodi (Ab) 1. Ab natural dan Ab imun Ab natural : merupakan IgM, timbul sbg akibat rangsangan bahan alami yg menyerupai Ag A/B (berasal dr bakteri/makanan atau produk bakteri) yg masuk tubuh, terbentuk ssdh umur 6 bln. Ab imun (Allo Ab) : merupakan IgG thd Ag pada individu dgn genetik berbeda ttp spesies sama, o.k masuknya Ag A dan/atau B kedlm tubuh melalui sirkulasi darah (transfusi, placenta) atau pemaparan thd produk darah

2. Complete Ab dan incomplete Ab Complete Antibody : Antibodi yg mampu menyebabkan aglutinasi langsung ( direk ) eritrosit-eritrosit yg tersuspensi di dalam salin (Ig M) Incomplete Antibody : Antibodi yg tidak mempunyai kemampuan untuk menyebabkan aglutinasi secara langsung dari eritrosit-eritrosit tsb tanpa penambahan fase antiglobulin (Ig G)

3. Ab tipe hangat ( Warm ) & Ab tipe dingin ( Cold ) Ab tipe warm : bereaksi lebih cepat pd 370 C (IgG) Ab tipe cold : bereaksi lebih cepat pd 200C (IgM)

Alur uji laboratorium pre-transfusi Pasien a. Serum a. Serum b. Eritrosit b. Eritrosit Donor Buat suspensi eritosit 5% dlm salin 10% dlm salin 40% dlm salin a/ serum Buat suspensi eritosit 5% dlm salin 10% dlm salin 40% dlm salin a/ serum Reaksi silang ABO Rh c. Pem gol ABO, Rh – metode slide, jika hasil OK: d. Reaksi silang MAYOR Fase I Fase II Fase III MINOR Fase I Fase II Fase III Minor + : sebab? - Ab donor ? - Ab melapisi eritr pasien ? Merup tes Coombs indirek e. CCC Cek dg tes Coombs Direk

Golongan darah Tipe gol drh ditentukan oleh ekspresi antigen di permukaan eritrosit (Antigen A, B, H) Ditemukan I x oleh Landsteiner th 1900 (Golongan A, B, O) Golongan AB ditemukan oleh Von Decastello & Sturli (1902) Identifikasi gol drh ditentukan dg melihat reaksi aglutinasi antara Ag & Ab

Substansi H Constantoulakis menemukan substansi H pd sel fetus dari semua golongan ABO (ada sejak lahir) Substansi H berguna untuk pembentukan antigen A, B dan H pd eritrosit Pembentukan Ag A, B dan H tsb ditentukan oleh interaksi gen ABO dan Hh Substansi H merup struktur dasar Ag A & B Bila tdp gen H pd prekursor substance mk akan diubah mjd substansi H bila ada gen A / B mk akan mjd Ag A atau B

Substansi H Shg seseorang dg gol A akan memp Ag A & H Gol B : memp Ag B & H Gen O, tak ada produk yg dpt dideteksi pd sel Gol O, tak ada substansi H yg diubah, hanya ditemukan substansi H saja Substansi H pada gol A & B < gol O Pd subgrup A, tak banyak substansi H yg diubah mjd Ag A bila reaksi thd Ag A menurun pd subgrup A yg lemah mk reaksi dg H mjd meningkat

Formasi antigen ABH Gen ABH tdk langsung nyata mengkode produksi antigen ABH, tp memproduksi ensim spesifik glycosyltransferase yg bertugas menambahkan gula-gula ke substansi prekursor (PS) dasar pd eritrosit Ag ABH dibentuk dr material prekursor dasar yg sama yang memp gycolipid backbone Tdp satu struktur molekul karbohidrat (KH) yang melekat pd backbone tsb paragloboside/rantai oligosakarida/substansi prekursor Formasi Ag ABH tergantung pd gula-gula yg ditambahkan Monosakarida terakhir (nukleotida) / gula-gula yg menempel pada rantai KH menentukan spesifisitas molekul

N-acetyl-D-galactosamin Ensim & gula-gula yang berperan dlm penyusunan antigen ABH Gene Glycosyltransferase (enzyme) Immunodominant Sugar Antigen H -2-L-fucosyltransferase L-fucose A -3-N-acetylgalactosaminyl transferase N-acetyl-D-galactosamin B -3-D-galactocylltransferase D-galactose

N-Acetylglucosamine (GLNAC) Glucose (GL) menent spesifisitas Material dasar: Galactose (GAL) N-Acetylglucosamine (GLNAC) Glucose (GL) Menyusun : Paragloboside a/ Oligosaccharide chain a/ Precursor substance Red blood cell precursor structure (which represents a paragloboside)

Gol O Gen H mengkode produkasi ensim L-fucocyltransferase Ensim tsb menempelkan Gula FUCOSE ke GAL Menyusun Antigen H Diekspresikan di permukaan eritrosit Gol O

Formasi antigen A Gol A Gen A mengkode produksi ensim N-Acetylgalactosaminyl transferase Ensim tsb menempelkan Gula N-acetyl-D-galactosamine (GALNAC) ke struktur H Menyusun Antigen A Diekspresikan di permukaan eritrosit Gol A

Formasi antigen B Gol B Gen B mengkode produksi ensim D-galactocyl transferase Ensim tsb menempelkan Gula D-galactose (GAL) ke struktur H Menyusun Antigen B Diekspresikan di permukaan eritrosit Gol B

Golongan A Golongan B Y Y Y B A Y Y Y Y Anti/aglutinin A H H Y B Y Y Anti B Anti A Y Anti/aglutinin A Antigen/aglutinogen A Antigen/aglutinogen B Anti/aglutinin B

Golongan AB Golongan O O Y - AB - Y - - Y - Y Y Anti/aglutinin A H B H Y - - Y - Y Anti B Anti A Y Anti/aglutinin A Antigen/aglutinogen A Antigen/aglutinogen B Anti/aglutinin B

Golongan darah Genotipe Gen Imunologi A AA atau AO Homozygot Heterozygot Memp Ag A & H Memp Anti B B BB Atau BO Memp Ag B & H Memp Anti A AB Memp Ag A, Ag B, Ag H Tidak punya anti O OO Memp Ag H Tdk punya Ag A & B Bombay hh Tdk memp Ag H, A & B Memp anti A, anti B, & anti H

Phenotype A dpt dibagi menjadi sub group : Sub grup dlm sistem ABO : A1 & A2 ± 80 % group A : ph A1 ± 20 % group A : ph A2 A2 : bereaksi lemah, kdg2 terdeteksi sbg Gol O A2B : bereaksi lemah, kdg2 terdeteksi sbg Gol B Antigen (Ag) yg termasuk sistem gol AB terdapat dlm : - eritrosit, endotel & epitel - cairan tubuh (mis : saliva) : glikoprotein Kualitatif dan Kuantitatif berbeda

Suami istri homozygot OO AO O Bisa A, B, O, AB Prob ms 25% BO AB B Anak A Istri Suami Suami istri heterozygot Suami A Anak B AB Semua Gol AB 100% Istri BO AB B Bisa B a/ AB Prob. 50:50 Anak O A Istri Suami Suami heterozygot A Istri homozygot B AO O Bisa A a/ AB Prob. 50:50 AB B Anak A Istri Suami Suami homozygot A Istri heterozygot B

OO AO O A 75% O 25% AA A Anak Istri Suami Suami heterozygot A Istri heterozygot A BO O 100% B Anak Istri Suami Suami homozygot B Istri homozygot O OO O 100% Anak Istri Suami Suami homozygot O Istri homozygot O BO AO O 50% A 50% B Anak B A Istri Suami Suami heterozygot AB Istri homozygot O

Golongan darah Bombay Darah Bombay adalah homozygot hh Jarang >> 99,9% individu : HH atau Hh Pertama kali ditemukan oleh Bhende di Bombay (1952) Dicurigai adanya darah yg tidak diaglutinasi oleh anti-A, anti-B, anti-AB dan anti-H Dituliskan sebagai golongan darah Oh untuk menunjukkan tidak adanya substansi H Gen h tidak memproduksi L-fucocyltransferase Memp Anti-A, anti-B, & anti-H

tidak memproduksi substrat H Seorang yang tidak mengekspresikan gen H (disbt juga genotype-nya hh) memp phenotype Bombay (Oh) tidak memproduksi substrat H gen A & B juga tdk bisa diekspresikan shg juga tidak mampu memproduksi Ag A dan Ag B

Perbedaan gol drh Oh dan O biasa Anti A Anti B Anti AB Anti H Sel A1 Sel A2 Sel B Sel O Oh/ Bombay - + O

Golongan BOMBAY Y Y BOMBAY h Y Anti B Y Anti A Anti/aglutinin H

Aglutinasi eritrosit oleh adanya reaksi antigen-antibodi ada 2 tahap : Tahap Sensitisasi Tahap Hemaglutinasi Lisis eritrosit terjadi bila seluruh rangkaian sistem komplemen teraktifkan menyertai interaksi Ag-Ab Aglutinasi terjadi bila Ab yg terikat menghubungkan eritrosit-eritrosit yg berdekatan membentuk gumpalan

Reaksi aglutinasi + Golongan B Y Y B B B Y Y B Anti-B Hemaglutinasi Anti A B Y Anti-B B Anti-B + Anti-B Hemaglutinasi = reaksi positif

Reaksi aglutinasi O O O O + Golongan O Y Y - - - Y Anti-A Y Y Anti A O - H O - Anti B O - Anti A Anti A Anti B Anti B Anti-B O Y + Tdk tjd hemaglutinasi = reaksi negatif Anti-A Anti-B Anti-AB

Reaksi penggolongan darah Eritrosit pasien Reaksi dg anti-A Reaksi dg anti-B Reaksi dg anti-AB Interpretasi 1 Negatif O 2 + A 3 B 4 AB

ANTIGLOBULIN TEST ( COOMBS TEST ) Definisi : Tes utk mendeteksi adanya antibodi tidak sempurna (incomplete antibody) yang diabsorpsi oleh eritrosit dengan jalan mereaksikan anti Ig G dan anti komplemen dengan eritrosit yg sudah tersensitisasi terjadi hemaglutinasi Serum Coombs : Serum kelinci yg telah diimunisasi dg fraksi globulin/Ig G manusia, sehingga disebut juga Serum Anti Globulin

Pembuatan serum Coombs: Serum manusia disuntikkan ke kelinci Kelinci membuat Ab thd serum mns yg disuntikkan, disebut Rabbit Antihuman globulin = serum Coombs Digunakan dlm Tes Coombs / Uji Antiglobulin

Direct Coomb’s Test Indikasi : untuk diagnosis HDN ( Hemolytic Disease of the Newborn ) AIHA ( Autoimmune Hemolytic Anemia ) Reaksi transfusi hemolytik Drug Induced Hemolytic Anemia Indirect Coomb’s Test Indikasi : Skrining Antibodi Deteksi Ab IgG; IgG anti Rh (D), lain2 Ig G Deteksi thd variant Rh yg bereaksi lemah, Ag Kell & Duffy Pada keadaan hipo/a- gamaglobuliemia/a-gamaglobulinemia Pada cross matching (reaksi silang)

Direct Antiglobulin Test ( Direct Coombs Test ) Untuk mendeteksi incomplete antibody yg melapisi eritrosit penderita in vivo Cara : Eritrosit penderita dicuci dengan salin untuk menghilangkan globulin plasma yang tidak bersifat antibodi spesifik Campur dengan serum Coombs tambahkan pada antibodi spesifik “incomplete“ yg diabsorbsi /melapisi eritrosit in vivo

DIRECT ANTIGLOBULIN TEST (DAT)/Direct Coombs Test Untuk mendeteksi incomplete antibody yg melapisi eritrosit penderita in vivo Ag Incompl Ab E + hemaglutinasi Serum Coombs

Indirek Antiglobulin Test / IAT ( Indirect Coombs Test ) Untuk mendeteksi incomplete antibody Ig G incomplete yang terdapat didalam serum penderita : Cara : Eritrosit normal dari golongan darah yg sama atau gol darah O disuspensikan ke dalam serum penderita dan diinkubasikan pada 370 C Sesudah dicuci dengan salin, tambahkan serum Coombs, disentrifus 1 menit pada 1000 rpm agglutinasi serum penderita mengandung antibodi tsb positif

IAT + E E 1 2 hemaglutinasi 3 4 Ag Cuci dg salin Ab dlm serum Inkubasi 37° C 1 2 Sentrifus 1000 rpm (1 menit) Cuci dg salin + Serum Coombs hemaglutinasi 3 4

Kd tes Coombs menghasilkan hasil NEGATIF PALSU, sebab: Pencucian eritrosit seblm pe + an serum Coombs kurang sempurna, msh tdp sisa globulin yg menetralkan serum Coombs Salin terkontaminasi oleh protein/globulin Lupa menambahkan serum Coombs Diperlukan Coombs Control Cells (CCC)

Sistim Rhesus Sampai saat ini dikenal 6 Ag: C & c, D & d, E & e Kombinasi: CDe, cDE, cDe, CDE, cdE, CdE, cde, Cde (terbanyak CDE, cDE, cde) Hasil: Rhesus + & Rhesus – Yang menentukan + a/ - adalah: ada tidaknya antigen D Berguna dalam klinik Rhesus - : >> orang kulit putih Indonesia: <<

Golongan Darah Rhesus ( Rh ) D + : gol darah Rh +, mempunyai Ag D D - : gol darah Rh - , genotipe cde/cde, tdk mempunyai Ag D, mampu membentuk Anti D bila terjadi pemaparan dg eritrosit Rh + Du : Rh + lemah, bereaksi lambat, sering keliru dengan D-

Reaksi silang (Crossmatch) Merupakan bagian dari tes kompatibilitas Tes kompatibilitas mengandung: 1. Review riwayat blood bank pasien & catatan pasien sebelumnya (transfusi, kehamilan) 2. Penggolongan drh ABO & Rh 3. Skrining antibodi 4. Reaksi silang

Kegunaan reaksi silang Cek final kompatibilitas ABO antar donor & pasien Mendeteksi antibodi dlm serum penderita yg akan bereaksi dg Ag donor, yg tak terdeteksi dg tes skrining Ab

Reaksi silang terdiri atas 2 macam : Reaksi Mayor : reaksi antara eritrosit donor dengan serum resipien Reaksi Minor : reaksi antara eritrosit resipien dengan serum donor Eritrosit Serum MINOR MAYOR Donor Resipien - -

3 fase reaksi silang Fase I : Fase suhu kamar dalam medium salin serum + suspensi sel dlm salin Suhu kamar 250 C Tahap penggolongan darah & deteksi complete Ab adanya cold autoagglutinin/auto-Ab tipe dingin adanya cold alloagglutinin/allo-Ab tipe dingin (anti A1, anti M, anti P1, anti Lewis dll)

Fase II : Fase inkubasi 37°C Tahap Rh grouping Incomplete Ab akan tersensitisasi Keseimbangan ikatan Ag-Ab berlangsung beb saat (15-60 memit) Inkubasi terlalu lama : sensitisasi melemah Inkubasi dlm Bovine Albumin 22% hanya 15 menit Kd incomplete Ab sistim Rh dpt terdeteksi (anti-D, anti-C, anti-E), tampak reaksi aglutinasi incomplete Ab lain spt K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb hanya tersensitisasi saja, tampak aglutinasi jika di + reagen Antiglobulin

Fase III : Fase Antiglobulin Mendeteksi incomplete Ab yg sudah melapisi eritrosit Sel pd fase II dicuci, kmd di + serum Coombs = Tes Coombs/Antiglobulin Indirek

Minor + : sebab? - Ab donor ? - Ab melapisi eritr pasien ? Cek dg tes Coombs Direk negatif positif Ab yg melapisi eritrosit pasien: AIHA HDN transfusi sebelumnya Ab donor