Metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins by cytochrome P450 BM-3 and it’s mutant Woro Triarsi Sulistyaningdyah1, Jun Ogawa1, Qing-Shan Li1, Raku.

Presentasi berjudul: "Metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins by cytochrome P450 BM-3 and it’s mutant Woro Triarsi Sulistyaningdyah1, Jun Ogawa1, Qing-Shan Li1, Raku."— Transcript presentasi:

1

2 Metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins by cytochrome P450 BM-3 and it’s mutant Woro Triarsi Sulistyaningdyah1, Jun Ogawa1, Qing-Shan Li1, Raku Shinkyo2, Toshiyuki Sakaki2,**, Kuniyo Inouye2, Rolf D. Schmid3 & Sakayu Shimizu1,* oleh : Martalia W. S Rini Hapsari Emy Indriastuti Received 29 July 2004; Revisions requested 26 August 2004; Revisions received 15 October 2004; Accepted 15 October 2004

3 AGENDA PRESENTASI Pendahuluan Tujuan Hipotesis Metodologi Hasil
Kesimpulan Implikasi

4 PENDAHULUAN Sitokrom P450
adalah enzim yang dapat larut dalam air dan terlibat pada proses metabolis. Beberapa contoh sitokrom P450 sebagai berikut: Sitokrom P450cam (CYP101) dari Pseudomonas putida  Sitokrom P450 eryF (CYP107A1) dari actinomycete bacterium Saccharopolyspora erythraea  Sitokrom P450 BM3 (CYP102A1) dari bakteri tanah Bacillus megaterium

5 Pseudomonas putida   Saccharopoldsdsyspora erythraea 

6 Bacillus megaterium

7 Penggunaan CYP

8 PENDAHULUAN BIOREMEDIASI
adalah penggunaan mikroorganisme untuk mengurangi polutan di lingkungan. JENIS-JENIS BIOREMEDIASI Biostimulasi Bioaugmentasi Bioremediasi intrinsik

9 JURNAL

10 JURNAL Dilakukan bioremediasi pada PCDD (polychlorinated dibenzo-p-dioxins) oleh cytochrome P450 BM-3 dari Bacillus megaterium dan mutasinya, yaitu AL4V. EKSPERIMEN Produk yang dihasilkan terhidroksilasi pada posisi rantai yang tak bersubstituen, dan berkurangnya toksisitas 10% dari senyawa aslinya.

11 PCDD (polychlorinated dibenzo-p-dioxins)

12 TUJUAN EKSPERIMEN Membandingkan aktivitas cytochrome P450 BM-3 dengan AL4V sebagai dekompositor pada bioremediasi PCDD (polychlorinated dibenzo-p-dioxins)

13 HIPOTESIS Mutasi / rekombinan dari P-450 seharusnya menunjukkan aktivitas bioremediasi yang lebih tinggi dibanding senyawa aslinya

14 METODOLOGI 1.Preparasi wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V 2. Pengukuran aktivitas katalitik wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V

15 Preparasi wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V
Wild-type P450 BM-3 dan mutan AL4V diekspresikan dalam E.Coli Koloni diambil kemudian ditanam di dalam 96 sumur yang mengandung 200 μL media TB dan100 μg/mL ampicillin Diinkubasi (overnight) pada 37oC 40 μL aliquot dari setiap sumur dimasukkan ke dalam tube yang terdiri atas 2 mL media TB dan 100 μg/mL ampicillin Ditumbuhkan selama 2 jam pada suhu 37oC kemudian selama 6 jam pada 42oC 300 mL kultur sel (OD578nm = 0,8-1) disentrifugasi (4000 rpm) selama 10 menit Diresuspensi dengan menggunakan buffer KH2PO4 (pH 7,4) Wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V

16 1-monochloro-dibenzo-p-dioxin
Pengukuran aktivitas katalitik wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V Dilarutkan dalam etanol 1mM 1-monochloro-dibenzo-p-dioxin (1-MCDD) Dilarutkan dalam dimetil sulfoksida 156 μM 2,3-DCDD 2,3,7-triCDD Dilarutkan dalam aseton 1mM 2,3,7,8-tetraCDD Larutan 1-MCDD Larutan 2,3-DCDD 2,3,7-triCDD Larutan 2,3,7,8-tetraCDD

17 10 μL dari setiap larutan PCDD
Pengukuran aktivitas katalitik wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V 10 μL dari setiap larutan PCDD (10 μM untuk 1-MCDD, 2,3-DCDD, 2,3,7-triCDD, dan 1,56 μM untuk 2,3,7,8-tetraCDD) Dicampurkan dengan 844 μL buffer KH2PO4 100 mM (pH 7,5), 80 μL 12% (w/v) glukosa, 8 μL U katalase/mL, 20 μL 761 U glukosa dehidrogenase/ mL, 20 μL larutan enzim (purified) Campuran Diinkubasi pada 30oC selama 2 menit setelah ditambah substrat. + 18 μL NADPH 12 mM shaker (170 rpm) dengan suhu 30oC Setelah menit, ditambah 3 mL kloroform/metanol (3:1)(v/v) Fasa Organik Diuapkan melalui evaporator

18 Konsentrasi akhir PCDDs
Pengukuran aktivitas katalitik wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V Residu Dilarutkan dengan asetonitril Dianalisis dengan menggunakan HPLC Sampel dielusikan dengan gradien linier % (v/v) asetonitril dalam larutan yang terdiri dari 0,01%TFA selama 25 menit, diikuti 100% aseonitril selama 10 menit, dan 20% (v/v) asetonitril selama 8 menit FR=1mL/menit λ = 227 nm Temperatur kolom = 40oC Konsentrasi akhir PCDDs

19 HASIL

20 HASIL

21 HASIL

22 KESIMPULAN Subtituen Klorida berbanding terbalik dengan aktivitas P450
Bakteri yang telah dimutasi (Al 4 V) dapat menjadi katalis dalam mendetoksifikasi tanah yang terkontaminasi PCDD. Aktivitas AL4V 2-12 kali lebih tinggi daripada WT sitokrom P450 BM-3 dalam hal mendekomposisi berbagai substrat yakni 1-MCDD, 2,3-DCDD, dan 2,3,7-triCDD

23 IMPLIKASI Bioremediasi Sebagai aktivator pada clopidogrel

24 DAFTAR PUSTAKA http://www.springerlink.com/content/g24t81p273352646/

25 Terimakasih..