Interaksi alamiah antara protein BJ-HCC-20A dan BRCA2

Presentasi berjudul: "Interaksi alamiah antara protein BJ-HCC-20A dan BRCA2"— Transcript presentasi:

1 Interaksi alamiah antara protein BJ-HCC-20A dan BRCA2
menghambat induksi apoptosis sebagai respon terhadap kerusakan DNA Go Tomiyoshi, Akira Nakanishi, Katsuya Takenaka, Kiyotsugu Yoshida and Yoshio Miki

2 PENDAHULUAN Faktor-faktor genetik kanker payudara: mutasi gen BRCA2.
Gen BRCA2  gen supresor tumor. BRCA2: peran penting dalam repair DNA (respon terhadap kerusakan DNA) BRCA2  pengaturan transkripsi, pengecekan siklus sel, inhibisi pertumbuhan sel, pertahanan stabilitas gen dan sitokinesis. Gen BRCA2 fosforilasi pada fase M siklus sel  berinteraksi dengan RAD51 (protein yang berperan utama dalam rekombinasi homolog DNA selama perbaikan kerusakan pita DNA).

3 Tahap G1 = "GAP 1". Tahap S = "Sintesis“  tahap saat terjadi replikasi DNA. Tahap G2 = "GAP 2". Tahap M = "mitosis",  saat terjadi pembelahan inti (kromosom memisah) dan sitoplasma (sitokinesis). Mitosis dibagi menjadi 4 fase. Pengaturan siklus sel Cdk (cyclin dependent kinase, menambah fosfat ke suatu protein)bersama dengan cyclin: kontrol utama siklus sel sebabkan sel berpindah dari G1 ke S atau G2 ke M MPF (Maturation Promoting Factor): includes the CdK and cyclins that triggers progression through the cell cycle. SIKLUS SEL

4 Aktivitas Cdk biasanya diakhiri oleh degradasi cyclin.
Cdk secara bergantian berikatan dengan cyclin untuk memicu tahap- tahap dari siklus sel. Aktivitas Cdk biasanya diakhiri oleh degradasi cyclin. (Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K and Walter P, "Molecular Biology of The Cell", 4th Ed., 2002)

5 Peran BRCA1 dan BRCA2 pada perbaikan DNA
Pembentukan kompleks makromolekul BRCA1, BRCA2, BARD1 dan Rad51 berfungsi untuk memperbaiki DNA yang rusak.  didahului oleh fosforilasi BRCA1 oleh ATM kinase. Kerusakan DNAkompleks ini pindah ke daerah kromosom yang sedang mengalami replikasi DNA (PCNA) Hilangnya fungsi BRCA1 dan/atau BRCA2  ketidakmampuan memperbaiki DNA yang rusak. Terjadi kerusakan pada gen checkpioint (mis.p53), checkpoints seperti p21 tidak dapat diaktifkan dan sel berproliferasi. Elsevier Science, from Ref. 11 [Welcsh, P.L, Owens, K.N. and King, M.C. (2000) Insights into the functions of BRCA1 and BRCA2. Trends in Genetics 16, 69-74

6 RAD51 Rad51 = protein yang berperan utama dalam rekombinasi homolog DNA selama perbaikan kerusakan untai ganda. Rad51 terlibat dalam tahap pencarian pasangan homologi dan pita DNA. Protein famili Rad51 membentuk suatu filamen heliks nukleoprotein pada DNA.

7 PENDAHULUAN Protein RAD51 selalu berikatan dengan BRCA1 dan BRCA2.
BRCA2 mengatur penempatan ke intraseluler dan kemampuan mengikat DNA dari protein RAD51. Hilangnya pengontrolan ini akibat inaktivasi BRCA2  peristiwa kunci sebabkan ketidakstabilan genom dan timbulnya tumor.

8 BRCA2

9 8 motif peptida BRC (penting untuk interaksi dengan RAD51)
BRCA2 Struktur skematik BRCA2: gambaran kunci dan domain dari protein BRCA2. Exon 11 (sangat besar) Ujung-C 8 motif peptida BRC (penting untuk interaksi dengan RAD51) Mengikat ssDNA

10 Interaksi antara RAD51 and BRCA2
Bila tidak ada BRCA2, inisiasi rekombinasi homolog terganggu, dan kesalahan repair (dan replikasi) terjadi secara cepat dalam tiap siklus sel

11 PENDAHULUAN Beberapa protein diketahui berinteraksi dengan regio/daerah BRCA2 yang terkonservasi  peran penting : perbaikan DNA  analisis fungsional regio tersebut penting KARSINOGENESIS KANKER PAYUDARA

12 METODE PENELITIAN peran BJ-HCC-20A sebagai respon kerusakan DNA?
Protein apa yang berinteraksi dengan regio terkonservasi BRCA2?  skrining ragi dua-hibrid  BJ-HCC-20A = protein asli yang berinteraksi dengan BRCA2  BJ-HCC-20 = antigen CT (cancer testis) Fungsi BJ-HCC-20? Antigen CT = terlibat pertumbuhan sel  efek overekspresi BJ-HCC-20A terhadap pertumbuhan sel dan apoptosis?  efek knock-down (pembungkaman) ekspresi BJ-HCC-20A menggunakan siRNA? peran BJ-HCC-20A sebagai respon kerusakan DNA? (karena BJ-HCC-20A secara in vivo membentuk kompleks dengan BRCA2).

13 METODE PENELITIAN Teknik-teknik: Skrining ragi dua-hibrid
Kultur sel MCF-7, HeLa dan U20S  Sinkronisasi kultur sel dengan nocodazole  transfeksi sel kultur dengan plasmid Pembuatan klon cDNA BJ-HCC-20A  pembuatan flag-tagged BJ-HCC-20A  GST-tagged BJ-HCC-20A  BJ-HCC-20A mutan  BRCA2 mutan Diklon ke dalam plasmid

14 METODE PENELITIAN Teknik-teknik:
Pembuatan antibodi anti-BJ-HCC-20 kelinci terhadap BJ-HCC-20 asam amino Antibodi anti-BRCA2 Antibodi anti-Flag Antibodi anti-GFP Antibodi anti-α-tubulin Imunopresipitasi Pemeriksaan pengikatan secara in vitro Transfeksi siRNA Sintesis siRNA duplex untuk BJ-HCC-20 RNA stealth siRNA1 & siRNA2 untuk BJ-HCC-20

15 METODE PENELITIAN Teknik-teknik: Pemeriksaan pembentukan koloni
Sel-sel HeLa ditransfeksi dengan vektor GFP atau GFP-BJ-HCC-20A Sel yang telah ditransfeksi dikultur Fiksasi sel dengan larutan Giemsa Pemeriksaan proliferasi sel Transfeksi sel Inkubasi dengan BrdU  imunofluoresensi Pemeriksaan apoptosis Visualisasi perubahan inti: sel difiksasi dan diwarnai dengan DAPI Deteksi sel-sel apoptotik: pemeriksaan TUNEL

16 PEMBAHASAN METODE PENELITIAN

17 Pemeriksan ragi dua-hibrid
Teknik untuk menemukan interaksi antara protein-protein atau antara protein-DNA  cara: pengujian interaksi fisik antara 2 protein atau antara satu protein dan molekul DNA

18 Pemeriksan ragi dua-hibrid
pengaktifan gen reporter downstream melalui pengikatan sebuah faktor transkripsi ke dalam sebuah upstream activating sequence (UAS). Faktor transkripsi dibagi menjadi 2 fragmen : binding domain (BD) dan activating domain (AD). BD = domain untuk pengikatan ke UAS AD = domain untuk pengaktifan transkripsi

19 MCF-7 MCF-7 : nama untuk sebuah sel induk adenokarsinoma payudara manusia (Human breast adenocarcinoma cell line). sel induk dengan kontrol positif reseptor estrogen yang sangat khas  berguna untuk model in vitro penelitian peran estrogen pada kanker payudara.

20 Sel HeLa Sel HeLa : sel-sel induk manusia imortal pertama  banyak digunakan pada penelitian ilmiah. berasal dari sel-sel kanker serviks  Henrietta Lacks, meninggal dunia akiat kanker pada tanggal 4 Oktober 1951. Sel-sel HeLa yang dilihat dengan mikroskop fase kontras

21 Sel U20S Galur sel U20S : dipanen dari jaringan tulang seorang wanita berusia 15 tahun  osteosarkoma. sarkoma yang berdiferensiasi secara moderat dari tibia. positif untuk reseptor faktor pertumbuhan mirip insulin I (IGF-1) dan faktor pertumbuhan mirip insulin II (IGF II) dan mengekspresikan sejumlah antigen, termasuk golongan darah A, Rh+, dan lain sebagainya.

22 Koimunopresipitasi  untuk penemuan interaksi protein
Protein target (antigen) berikatan dengan protein partnernya Suatu antibodi terhadap target spesifik membentuk kompleks imun dengan protein target dalam lisat sel protein partner antigen tersebut juga ikut berpresipitasi kompleks imun diikat oleh protein A atau G = presipitasi Protein-protein yang tidak berpresipitasi: dicuci dibuang komponen-komponen kompleks imun dielusi dan dianalisa dengan SDS PAGE Deteksi western blot untuk verifikasi identitas antigen Koimunopresipitasi

23 Flag-Tag Masalah teknis analisis ekspresi klon cDNA :
kurang pemeriksaan fungsional dan/atau Kurang antibodi spesifik untuk protein-protein yang dihasilkan.  Dibuat suatu protein fusi yang diikatkan ke produk ekspresi cDNA tersebut  contohnya: Flag-Tag, His- tag dan GST-tag

24 GST-tag GST (glutathione S-transferase)  membuat sistem fusi gen GST  berguna untuk memurnikan dan mendeteksi protein yang diinginkan. berguna untuk pemeriksaan interaksi langsung protein-protein. Contoh dalam penelitian ini : pemeriksaan interaksi protein BRCA2 dengan protein BJ-HCC-20.  BJ-HCC-20 difusikan dengan GST, sehingga jika BJ-HCC-20 berikatan dengan BRCA2, maka fusi protein GST-BJ-HCC-20 juga akan berikatan dengan BRCA2, sehingga BRCA2 juga akan ditemukan pada pemeriksaan bead.

25 GST-tag GST (glutathione S-transferase)  membuat sistem fusi gen GST  berguna untuk memurnikan dan mendeteksi protein yang diinginkan. berguna untuk pemeriksaan interaksi langsung protein-protein. Contoh dalam penelitian ini : pemeriksaan interaksi protein BRCA2 dengan protein BJ-HCC-20.  BJ-HCC-20 difusikan dengan GST, sehingga jika BJ-HCC-20 berikatan dengan BRCA2, maka fusi protein GST-BJ-HCC-20 juga akan berikatan dengan BRCA2, sehingga BRCA2 juga akan ditemukan pada pemeriksaan bead.

26 siRNA RNA interference (RNAi) : bentuk pengaturan gen post-transkripsi  molekul RNA untai ganda (dsRNA) non-translated yang disebut dengan small interfering RNA (siRNA) memperantarai degradasi spesifik sekuen dari mRNA. Struktur siRNA sangat spesifik untuk mencegah kesalahan pada silencing gen. Molekul siRNA = nukleotida dsRNA duplex dengan 2-3 nukleotida menggantung pada ujung 3’ dan gugus fosfat 5’ dan hidroksil 3’.

27 RNA Stealth RNAi Stealth = oligonukleotida RNA untai ganda 25 pasang basa yang struktur kimianya dimodifikasi. Dibandingkan dengan siRNA, RNAi Stealth :  memberikan respon penekanan nonspesifik pada hasil yang lebih jelas,  berpotensi besar untuk pembungkaman gen, dan  memberikan kestabilan baik pada sistem kultur sel dan in vivo.

28 METODE PENELITIAN Skrining ragi 2 hibrid
protein novel (asli) yang berinteraksi dengan BRCA2, yaitu : BJHCC-20 (Gb. 1a) Konfirmasi interaksi antara BJ-HCC-20 dan BRCA2 - BRCA2 (aa ) berinteraksi dengan BJ-HCC-20A - BJ-HCC-20A (aa 1-105) berinteraksi dengan BRCA2 imunopresipitasi, imunoblot BJ-HCC-20A berinteraksi dengan BRCA2 pada sistem yang terekspresi berlebihan (Gb. 1b) Menentukan regio pengikatan dari BJ-HCC-20A dan BRCA2

29 Pemeriksan ragi dua-hibrid
Skrining pustaka cDNA tikus menggunakan sebagian regio BRCA2 yang sangat terkonservasi (aa ) bait Beberapa klon kandidat Analisis sekuen DNA 5 klon terletak pada kromosom X tikus

30 Pemeriksan ragi dua-hibrid
Analisis BLAST Homolog dengan protein BJ-HCC-20 pada manusia protein novel (asli) yang berinteraksi dengan BRCA2, yaitu : BJHCC-20

31 Fig. 1. Interaction of BJ-HCC-20A and BRCA2
STRUKTUR BJ-HCC20A dan BJ-HCC-20B. Blue box = variable region BJ-HCC- 20A dan BJ-HCC-20B.

32 Konfirmasi interaksi antara BJ-HCC-20 dan BRCA2 pada sel-sel mamalia
Flag-tagged BRCA2 HA-tagged BJ-HCC-20A plasmid Sel MCF-7, HeLa, U20S Antibodi anti-BJ-HCC-20 Lisat sel Antibodi anti-BRCA2 Matrix anti-HA koimunopresipitasi Protein A atau G imunoblot Antibodi anti-BRCA2 Antibodi anti- BJ-HCC-20 antibodi anti-HA antibodi anti-GFP antibodi anti- α-tubulin

33 Konfirmasi interaksi antara BJ-HCC-20 dan BRCA2 pada sel-sel mamalia
HA-tagged BJ-HCC-20 Overekspresi pada sel-sel HeLa Imunopresipitasi dengan anti- HA, IgG tikus normal, anti- BRCA2 Gbr. 1b. Imunoblot dengan anti-HA atau anti-BRCA2 BJ-HCC-20A berinteraksi dengan BRCA2 pada sistem yang terekspresi berlebihan

34 Menentukan regio pengikatan dari BJ-HCC-20A dan BRCA2
Protein-protein fusi-GST dari fragmen BRCA2 Protein-protein fusi-GST dari fragmen BJ-HCC-20A lisat sel MCF- 7, HeLa, U20S purifikasi inkubasi Antibodi anti-HA imunoblot Antibodi anti-Flag imunoblot Antibodi anti-GST BRCA2 (aa ) berinteraksi dengan BJ-HCC-20A BJ-HCC-20A (aa 1-105) berinteraksi dengan BRCA2

35 Fig. 1. Interaction of BJ-HCC-20A and BRCA2
Tiap pita spesifik untuk fragmen GST-BJ-HCC-20A dan BRCA2 ditandai dengan asterisk. IB, immunoblot; IP, immunoprecipitation.

36 Menentukan interaksi antara BJ-HCC-20 endogen dan BRCA2
UJI KONTROL HA-BJ-HCC-20A Lisat sel MCF-7 transfeksi Lisat sel MCF-7 imunopresipitasi Gbr. 2a. Karakterisasi antibodi anti-BJ-HCC-20 imunoblot Antibodi anti-BJ-HCC-20 poliklonal kelinci terhadap peptida sintetik yang sesuai dengan aa BJ-HCC-20A BJ-HCC-20A endogen sebagai protein 29-kDa pada sel-sel MCF-7

37 Menentukan interaksi antara BJ-HCC-20 endogen dan BRCA2
UJI KONTROL Lisat sel MCF-7 Imunopresipitasi dengan IgG normal kelinci atau tikus Imunopresipitasi dengan antibodi anti-BJ-HCC-20 atau anti-BRCA2 Gbr. 2b. Interaksi antara BJ- HCC-20A endogen dan BRCA2 imunoblot Antibodi anti-BJ-HCC-20 dan antibodi anti-BRCA2 Interaksi antara BJ-HCC-20A endogen dan BRCA2 Fokus pada BJ-HCC-20A

38 Meneliti interaksi antara BJ-HCC-20A dan BRCA2 selama fase M
transfeksi Vektor HA atau HA—BJ-HCC-20A sel HeLa 24 jam Disinkronisasi pada fase M dengan pemberian nocodazole Imunopresipitasi dengan antibodi anti-HA atau anti-BRCA2 Imunoblot dengan antibodi anti-BJ-HCC-20 atau antibodi anti-BRCA2 BJ-HCC-20A tidak berinteraksi dengan BRCA2 yang terfosofrilasi spesifik pada fase M

39 Fig. 3. Modulation of BJ-HCC-20A binding with an M phase-specific phosphorylated BRCA2
Terjadi perubahan pada mobilitas elektrofilik protein BRCA2 setelah diberi nocodazole (lajur 2, 4, 6) BJ-HCC-20A tidak berinteraksi dengan BRCA2 yang terfosforilasi spesifik pada fase M dengan pemberian nocodazole (lajur 10).

40 METODE PENELITIAN peran BJ-HCC-20A sebagai respon kerusakan DNA?
Protein apa yang berinteraksi dengan regio terkonservasi BRCA2?  skrining ragi dua-hibrid  BJ-HCC-20A = protein asli yang berinteraksi dengan BRCA2  BJ-HCC-20 = antigen CT (cancer testis) Fungsi BJ-HCC-20? Antigen CT = terlibat pertumbuhan sel  efek overekspresi BJ-HCC-20A terhadap pertumbuhan sel dan apoptosis?  efek knock-down (pembungkaman) ekspresi BJ-HCC-20A menggunakan siRNA? peran BJ-HCC-20A sebagai respon kerusakan DNA? (karena BJ-HCC-20A secara in vivo membentuk kompleks dengan BRCA2).

41 METODE PENELITIAN Overekspresi BJ-HCC-20A dengan transfeksi GFP-BJ-HCC-20A Analisis ekspresi mRNA dengan RT-PCR BJ-HCC-20A mendorong pertumbuhan sel pada sel-sel HeLa knock-down ekspresi mRNA BJ- HCC-20 pada sel-sel U20S dan HeLa akibat siRNA BJ-HCC-20 Konfirmasi keterlibatan BJ-HCC-20A dalam pertumbuhan sel Knock-down BJ-HCC-20A endogen dengan siRNA Penekanan pertumbuhan sel pada sel-sel yang ditransfeksikan siRNA1 BJ-HCC-20 Kadar ekspresi BJ-HCC-20 endogen menurun pada sel-sel MCF-7 yang ditransfeksikan dengan siRNA1 BJ- HCC-20 Pemeriksaan proliferasi sel dengan BrdU

42 Menentukan efek BJ-HCC-20A terhadap pertumbuhan sel
transfeksi Vektor GFP atau GFP-BJ-HCC-20A Sel HeLa Pemeriksaan pembentukan koloni BJ-HCC-20A terekspresi berlebihan pada sel-sel HeLa BJ-HCC-20A mendorong pertumbuhan sel pada sel-sel HeLa imunoblot Antibodi anti-GFP Gbr. 4a

43 Konfirmasi apakah BJ-HCC-20A terlibat dalam pertumbuhan sel
siRNA1 BJ-HCC-20 transfeksi Sel-sel MCF-7 48 jam Ekspresi BJ-HCC-20 endogen dibungkam (knock-down) Imunopresipitasi dengan anti-BJ-HCC-20 kontrol Imunoblot dengan anti- BJ-HCC-20 Imunoblot dengan anti- α-tubulin Kadar ekspresi BJ- HCC-20 endogen menurun Gbr. 4b

44 Analisis dengan RT-PCR
Konfirmasi apakah BJ-HCC-20A terlibat dalam pertumbuhan sel siRNA1 BJ-HCC-20 transfeksi Sel-sel U20S dan HeLa 48 jam Ekstraksi RNA total Ekspresi BJ-HCC-20 endogen diturunkan (down-regulation) Analisis dengan RT-PCR Pemeriksaan proliferasi sel dengan BrdU knock-down ekspresi mRNA BJ- HCC-20 akibat siRNA BJ-HCC-20 Hitung min. 700 sel dari 5 lapang pandang Hitung sel-sel yang positif BrdU Gbr. 4c Penekanan pertumbuhan sel pada sel-sel yang ditransfeksikan siRNA1 BJ-HCC-20

45 Fig. 4. Expression of BJ-HCC-20A promotes cell growth
Hasil penghitungan persentase sel yang positif BrdU (atas) presentase sel yang ditransfeksikan dengan siRNA lebih sedikit Efek knock-down ekspresi mRNA BJ-HCC-20 akibat siRNA BJ-HCC-20 pada sel- sel U20S dan HeLa (bawah) tidak terlihat pita

46 apakah terjadi perubahan inti yang apoptotik?
transfeksi siRNA1 BJ-HCC-20 Sel-sel U20S dan HeLa 48 jam Ekspresi BJ-HCC-20 endogen diturunkan (down-regulation) Pemeriksaan perubahan inti apoptotik (sel difiksasi & diwarnai dengan DAPI) Hitung min. 800 sel dari 5 lapang pandang Gbr. 5a. c=condensation; f=fragmentation Hitung persentase sel-sel dengan perubahan inti apoptotik Peningkatan sel-sel dengan perubahan inti yg apoptotik

47 apakah perubahan morfologi sel akibat down-regulation BJ-HCC-20A disebabkan induksi apoptosis?
transfeksi siRNA1 BJ-HCC-20 Sel-sel U20S dan HeLa 72 jam Ekspresi BJ-HCC-20 endogen diturunkan (down-regulation) Pemeriksaan TUNEL Hitung min. 600 sel dari 5 lapang pandang Hitung persentase sel-sel dengan TUNEL positif Gbr. 5b Peningkatan induksi apoptosis

48 METODE PENELITIAN peran BJ-HCC-20A sebagai respon kerusakan DNA?
Protein apa yang berinteraksi dengan regio terkonservasi BRCA2?  skrining ragi dua-hibrid  BJ-HCC-20A = protein asli yang berinteraksi dengan BRCA2  BJ-HCC-20 = antigen CT (cancer testis) Fungsi BJ-HCC-20? Antigen CT = terlibat pertumbuhan sel  efek overekspresi BJ-HCC-20A terhadap pertumbuhan sel dan apoptosis?  efek knock-down (pembungkaman) ekspresi BJ-HCC-20A menggunakan siRNA? peran BJ-HCC-20A sebagai respon kerusakan DNA? (karena BJ-HCC-20A secara in vivo membentuk kompleks dengan BRCA2).

49 Menentukan efek BJ-HCC-20A dalam kerusakan DNA
Agen perusak DNA ADR Primer BJ-HCC-20 Primer β-actin Sel-sel U20S, HeLa, MCF-7 24 jam Pemeriksaan RT-PCR ADR sebabkan penurunan ekspresi mRNA BJ-HCC-20A Gbr. 6a

50 Menentukan efek BJ-HCC-20A dalam kerusakan DNA
HA-BJ-HCC-20A Agen perusak DNA ADR transfeksi Sel-sel U20S, HeLa, MCF-7 24 jam Pemeriksaan TUNEL Hitung min. 300 sel dari 3 lapang pandang Hitung persentase sel-sel dengan TUNEL positif Ekspresi BJ-HCC-20A menghambat apoptosis yang diinduksi ADR signifikan Gbr. 6b

51 Meneliti lebih lanjut keterlibatan BJ-HCC-20A dalam kerusakan DNA
siRNA BJ-HCC-20A Agen perusak DNA ADR transfeksi Sel-sel U20S, HeLa, MCF-7 24 jam Pemeriksaan TUNEL Hitung min. 300 sel dari 3 lapang pandang Hitung persentase sel-sel dengan TUNEL positif Kombinasi down-regulasi ekspresi BJ-HCC-20 dan kerusakan DNA  meningkatkan apoptosis yang diinduksi ADR Gbr. 6c

52 Apakah down-regulasi BJ-HCC-20A mempengaruhi ekspresi BRCA2 sebagai respon terhadap kerusakan DNA?
Agen perusak DNA ADR siRNA BJ-HCC-20A transfeksi Sel-sel U20S, HeLa, MCF-7 24 jam Lisat sel Ekstraksi RNA Imunoblot: anti-BRCA2 Pemeriksaan RT-PCR (primer: BJ-HCC-20, BRCA2, β-actin Down-regulasi BJ-HCC-20A mendorong penurunan ekspresi BRCA2 sebagai respon terhadap keruskaan DNA (dibandingkan kontrol) Gbr. 6d

53 PEMBAHASAN HASIL BJ-HCC-20 = antigen CT = ditemukan pada kanker dan testis normal antigen CT:  terlibat dalam pertumbuhan sel  berperan dalam gambaran fenotipe kanker ekspresi BJ-HCC-20A berlebihan:  meningkatnya pertumbuhan sel Down-regulasi BJ-HCC-20A:  penekanan pertumbuhan sel

54 PEMBAHASAN HASIL Down-regulasi BJ-HCC-20A dengan siRNA:
 induksi apoptosis  BJ-HCC-20A = antiapoptosis BJ-HCC-20A: Mendorong pertumbuhan dengan cara menghambat induksi apoptosis

55 PEMBAHASAN HASIL BRCA2: terlibat dalam perbaikan kerusakan DNA dan apoptosis Agen perusak DNA (mis. ADR):  down-regulasi ekspresi BRCA2 pada sel-sel kanker mRNA BJ-HCC-20 juga menurun akibat induksi ADR Penurunan ekspresi BJ-HCC-20 oleh siRNA:  meningkatkan apoptosis sel  mendorong penurunan ekspresi BRCA2 sebagai akibat dari kerusakan DNA

56 PEMBAHASAN HASIL Perbaikan ekspresi BJ-HCC-20A menghambat apoptosis akibat kerusakan DNA

57 PEMBAHASAN HASIL Mutasi sel germinal yang menginaktifkan BRCA2 berpotensi menyebabkan kanker. Sel-sel yang kekurangan BRCA2 menunjukkan perubahan jumlah kromosom (aneuploidi), seperti halnya kromosom yang rusak strukturnya. Defisiensi BRCA2 mengganggu penyelesaian pembelahan sel melalui sitokinesis.

58 PEMBAHASAN HASIL Inaktivasi BRCA2 pada fibroblast embrio murin dan sel-sel HeLa melalui kerusakan gen target atau siRNA akan memperlambat dan mencegah pembelahan sel. Terhambatnya pemisahan sel saat mitosis adalah akibat dari ketidaknormalan pengaturan myosin II selama tahap akhir sitokinesis.  BRCA2 mungkin memiliki peran dalam mengatur peristiwa ini, karena terletak di tengah sel yang sedang sitokinesis (membelah). (Daniels et al., 2004)