PENDAHULUAN KROMATOGRAFI Oleh : Nina Salamah, MSc., Apt.

Presentasi berjudul: "PENDAHULUAN KROMATOGRAFI Oleh : Nina Salamah, MSc., Apt."— Transcript presentasi:

1 PENDAHULUAN KROMATOGRAFI Oleh : Nina Salamah, MSc., Apt.
Fakultas Farmasi Universitas Ahmad Dahlan

2 Kromatografi gas Kromatografi Cair
Menurut Willard et at, (1989), pembagian kromatografi dapat dibuat bagan sebagai berikut: Kromatografi Kromatografi gas Kromatografi Cair Gas-cair Gas padat Cair-cair Cair-padat (GLC) (GSC) LLC LSC Eksklusif Penukar ion EC IEC Fase terikat Pasangan ion

3 Pembagian diatas berdasar jenis fase, ialah cair dan gas,
Pembagaian kedua : penukar ion dan eklusif serta pasangan ion hanya mengetengahkan salah satu fase diam, Willard : kedua kromatografi penukar ion dan eklusif merupakan kromatografi yang berdasar pada interaksi antara linarut dan fase diam. Berdasarkan kesetimbangan yang terjadi dibedakan menjadi 2 ialah: adsorbsi, dan partisi yang dapat terjadi baik dalam kromatografi gas maupun kromatografi cair.

4 Berdasarkan Proses Pemisahan
a. Kromatografi adsorbsi b. Kromatografi partisi c. Kromatografi pasangan ion d. Kromatografi penukar ion e. Kromatografi eksklusif f. Kromatografi afinitas,

5 C.TEORI PEMISAHAN Teori dan Mekanisme dari berbagai pemisahan.
 1. Pemisahan Adsorpsi Peristiwa adsorpsi oleh fase diam terhadap fase gerak dan linarut selalu terjadi kompetitif Kemampuan fase diam mengadsorpsi keduanya sangat tergantung pada topografi gugus aktif yang terdapat pada masing -masing komponen. Fase diam dari silica yang mempunyai gugas hidroksil dari silanol (Si-OH) dapat terjadi interaksi dengan gugus pada linarut maupun pada fase gerak.

6 Peristiwa adsorbsi umumnya terjadi pada kromatografi padat cair (liquid solid chromatography, atau LSC, terjadi pada KLT). Dapat pula terjadi pada Gas solid chromatography atau Kromatografi gas (KG) yang berinteraksi antara fase diam dan linarutnya. Fase gerak pada kromatografi gas, tidak mempunyai gugus aktif yang dapat berinteraksi dengan fase diam.

7 Rumus Koefisien Distribusi (KD)
KD =CS/CM CS menyatakan kadar linarut dalam fase diam (stationair phase), dan CM kadar linarut dalam fase gerak (mobile phase). Persamaan diatas menunjukkan bahwa linarut X lebih banyak berinteraksi dengan fase diam karena indeknya lebih kecil dan jumlah dalam masing-masing fase juga sangat kecil. Dengan pedoman tersebut berarti kadar linarut dalam fase diam selalu lebih kecil dari kadar linarut dalam fase gerak.

8 Berdasarkan hal di atas maka harga KD selalu lebih kecil dari 1, Tetapi mungkin dapat terjadi yang sebaliknya. Adsorpsi linarut oleh fase diam sangat tergantung pada: a. Struktur kimia linarut atau adanya gugus aktif yang ada b. Ukuran partikel fase diam, makin kecil ukuran partikel fase diam makin luas permukaannya sehingga kontak dengan linarut makin luas. c. Kelarutan linarut dalam fase gerak, makin mudah larut linarut dalam fase gerak, linarut makin mudah lepas dari fase diam.

9 Contoh interaksi antara beberapa senyawa aromatik dengan silica
d. Kemampuan interaksi (isotermik) yang terjadi antara fasediam dan fase gerak. Contoh interaksi antara beberapa senyawa aromatik dengan silica H O OH H O H O H O H O H O H O OH OH OH Si Si Si Si Si O O O O

10 Penggolongan tipe adsorbsi isotermik
Peristiwa adsorbsi isotermik dapat digolongkan dalam beberapa tipe yaitu : a.Tipe konkap terjadi apabila mula-mula linarut tidak kuat interaksinya. kemudian menjadi lebih kuat sehingga terikat lama pada fase diam. berarti K < 1 b. Tipe normal(linier) Ikatan yang terjadi tetap. Sehingga berupa garis lurus dan K = 1. c. Tipe konvek, Adsorpsi mula-mula terikat kuat oleh fese diam, makin lama makin lemah sehingga bentuk kurvanya menjadi konvek atau harga K>1

11 Penggolongan tipe adsorbsi isotermik
Puncak berekor Tipe a dan b tersebut yang sering menyebabkan terjadinya pelebaran puncak lihat gambar 3.2

12 Contoh gambar adsorbsi isotermik
Konveks Berekor/tailing Berekor/tailing Normal/linier Normal/bulat Normal/semitris Konkaf Leading(pendahulu) Leading(pendahulu)

13 a. Jenis fase diam Fase diam untuk kromatografi adsorbsi yang paling banyak digunakan adalah silica gel Partikel fase diam mempunyai bentuk dan ukuran yang berbeda. Ukuran makin kecil akan makin memperluas permukaan fase diam, dan memperluas pula gugus aktif dan fase diam yang aktif berhubungan dengan linarut Bentuk dengan pori yang dalam, bila pori tersebut sangat banyak akan menaikkan harga K, yang jauh lebih besar dan 1 dan menimbulkan garis kurva adsorbsi isotermik yang konkaf

14 Makin dangkal pori yang ada, makin efisien untuk pemisahan.
Pedoman memilih fase diam dengan sebagai berikut: 1).Fase diam yang bentuk pelikuler (pori yang dalam) akan menambah efisiensi, tetapi menaikkan kapasitasnya. 2). Bentuk pelikuler umumnya dibuat packing dengan cara kering c= tidal berporus a=porus dangkal b=porus dalam

15 3/. Bentuk mikroporus, dikemas secara basah (adonan atau slurry, permukaan jadi luas menambah harga K) 4/. Bila pemisahan antara linarut sukar, sebaiknya menggunakan mikroporus, karena efisiensinya makin tinggi, luas permukaan partikel makin besar, sehingga kontak dengan linarut makin banyak (K menjadi besar). Kejadian tersebut akan menaikkan sifat selektivitas fase diam terhadap linarut, dan kapasitas fase diam akan menjadi lebih besar.

16 Tabel I.I Beberapanama adsorben/penjerap dan ukurannya (Johson dan Stevenson 1979)
Tipe Nama Ukuran(nm) Sifat Luas m 2 g Silica aktif Pellosil Corasil (HS dan HC Perrisorb A Vydac 37-50 37-44 30-40 30-44 Asam- lemah 1-7dan 11-1 HS-4 HC-8 14,12, Alumina Pellumina HS dan HC Basa lemah HS-4 & HC-8 Lain- lain Pellidon Perrisorb PA Diatomeae Lempung Celite 45 non polar 1 0,5 HS =High solution HC=High capacity

17 2. Pemisahan Partisi Pemisahan cara partisi sangat erat kaitannya dengan kelarutan senyawa ke dalam pelarut. Dalam kromatografi didasarkan pada kelarutan linarut dalam fase diam maupun fase cair, maka terdapat istilah koefisien partisi, yang peristiwanya akan mengembang menjadi koefisen distribusi yang umumnya berlaku pada kromatografi. Koefisien partisi dapat dinyatakan sebagai perbandingan kadar(kelarutan) linarut dalam fase diam dengan kadar(kelarutan) linarut dalam fase gerak.

18 Sedangkan secara umum adalah perbandingan kelarutan senyawa dalam oktanol dibanding kelarutannya dalam air. Sifat linarut dalam kromatografi dapat digambarkan dalam berbagai cara, pada kromatografi kolom dikenal dengan volume tambat atau VR. VR (sesuai dengan jumlah volume fase gerak yang digunakan untuk membawa satu linarut keluar dari kolom). Tetapi bila dinyatakan dengan tR (waktu tambat) menyatakan waktu yang diperlukan fase gerak membawa linarut keluar dari kolom. c VR1 a VR2 b

19 Sedangkan waktu yang diperlukan untuk membawa linarut bergerak dari satu titik ke titik yang lain dalam KLT atau elektroforese disebut Rf. Satuan ini merupakan perbandingan jarak yang ditempuh linarut dengan jarak yang ditempuh pelarut (fase gerak) dalam waktu yang sama Jarak migrasi sampel Rf =  Jarak migrasi pelarut Tetapan partisi dengan inial k' (perbandingan kadar linarut dalam fase diam dibanding dengan kadar linarut dalam fase gerak). Rumusnya adalah: seperti k’= CsVs/ (CmVm)

20 Kromatografi eksklusif pemisahannya atas dasar ukuran molekul linarut, utamanya pada molekul yang besar, sehingga dinamakan pula kromatografi filtrasi. Pada kromatografi filtrasi dapat pula terjadi pada kromatogarfi gas tetapi dengan ukuran molekul yang kecil disebut moleculer shiever Teori tersebut perlu dibahas terpisah sesuai dengan topik dan aplikasinya.

21 LIQUID-LIQUID CHROMATOGRAPHY
ODPN (oxydipropionylnitrile) Normal Phase LLC Reverse Phase LLC NCCH 3 CH 2 OCH CN(Normal) (CH ) 16 (Reverse) The stationary solid surface is coated with a 2nd liquid (the Stationary Phase) which is immiscible in the solvent (Mobile) phase. Partitioning of the sample between 2 phases delays or retains some components more than others to effect separation.

22 ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
SO 3 - Na + Separation in Ion-exchange Chromatography is based on the competition of different ionic compounds of the sample for the active sites on the ion-exchange resin (column-packing).

23

24 Types of Ion Exchange Resins
Type of Exchanger Functional Exchanger Group Trade Name Cation Strong Acid Sulfonic acid (-SO3-H+) Dowex 50; Amberlite IR 120 Weak acid Carboxyclic acid (-CO2-H+) Amberlite IRC 50 Anion Strong base Quaternary ammonium ion (-NR3+OH-) Dowex 1; Amberlite IRA 400 Weak base Amine group (-NH3+OH-) Dowex 3; Amberlite IR 45

25 Chromatography Conditions associated with each kind of chromatography
Ion exchange chromatography Organic cation exchange resins involve crosslinked polystyrene containing either SO3- or COO- functional groups with an associated cation Organic anion exchange resin involve crosslinked polystyrene containing NH3+ functional groups with an associated anion The affinity of dissolved ions for the resin varies with the ion and the composition of the solution

26 nRzSO3–H+ + Mn+ (RzSO3)nM + nH+
nRzCO2–H+ + Mn (RzCO2)nM + nH+ nRzNR3+OH-+ An (RzNR3)nA + nOH-

27 MECHANISM OF ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS
+ + SO 3 Na H N 3 COOH Ion-exchange Resin - + SO H N 3 3 - COO pH4.5 + Na

28 Chromatography of Amino Acids

29 Some Applications of Ion Exchange Chromatography
Purifications a mixed bed cation-anion exchanger remove salts (ex CaCl2) from water by exchanging them for H2O :Deionization of water Concentrations The concentration of trace elements in seawater. Analytical Separations Separations of metal ions and amino acid or halide ions

30 SIZE EXCLUTION CHROMATOGRAPHY
Gel-Permeation Chromatography is a mechanical sorting of molecules based on the size of the molecules in solution. Small molecules are able to permeate more pores and are, therefore, retained longer than large molecules.

31 SIZE EXCLUTION CHROMATOGRAPHY
Molecules that can penetrate the gel particles are separated based on size and shape. Others pass straight through the column. Gel filtration chromatography : mobile phase is water. Gel permeation chromatography : mobile phase is an organic solvent. Sephadex is popular molecular-sieve material 4 the separation of proteins.

32 Teori pemisahan Pemisahan yang terjadi dalam sistem selalu mengalami keseimbangan yang dinamis, baik pemisahan tersebut karena peristiwa adsorbsi partisi, penukaran ion, permiasi, maupun cara afinitas. tR2 tR1 tm menit

33 Resolusi (Daya Pisah) Kromatografi digunakan untuk analisis, tetapi tujuan utama semula adalah untuk pemisahan, sehingga dalam analisis campuranpun diutamakan pemisahannya. Untuk mendapatkan harga pemisahan yang dikehendaki berdasar pada rumus berikut: (tR2- tR2) R = ————— ,5(W1+W2)   syarat harga R agar terjadi pemisahan dengan baik paling tidak 1,25. Kalau hanya 1 masih ada tumpang tindih sebesar 2% antara puncak 1 dan puncak 2.

34 Applications of Chromatography
Qualitative Analysis Quantitative Analysis Analyses Based on Peak Height Analyses Based on Peak Areas Calibration and Standards The Internal Standard Method The Area Normalization Method

35