Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

Presentasi sedang didownload. Silahkan tunggu

KLT-Densitometer. TLC (Thin Layer Chromatography) Pengembangan versi modern dari kromatografi kertas Kertas diganti oleh lapisan fasa diam (silika gel,

Presentasi serupa


Presentasi berjudul: "KLT-Densitometer. TLC (Thin Layer Chromatography) Pengembangan versi modern dari kromatografi kertas Kertas diganti oleh lapisan fasa diam (silika gel,"— Transcript presentasi:

1 KLT-Densitometer

2 TLC (Thin Layer Chromatography) Pengembangan versi modern dari kromatografi kertas Kertas diganti oleh lapisan fasa diam (silika gel, alumina) berukuran ( μm) yang dilapiskan pada kaca ( cm) HPTLC = metode perkembangan terkini dari TLC Kelebihan: ukuran partikel fasa diam yang seragam Fasa diam termodifikasi Prosedur operasional yang otomatis reprodusibilitas lebih baik

3 Thin Layer chromatography (TLC) Proses Deteksi Analit (Komponen Sampel) Analit Berwarna Prosedur Derivatisasi Densitometri dengan scanner sinar UV UV light beam Reflected beam Detector Pseudo-chromatogram

4 KLT DENSITOMETER Metoda analisis instrumental yang berdasarkan interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT Alat dilengkapi dengan spektrofotometer yang mempunyai radiasi sinar pada panjang gelombang nm. Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)

5 *Chamber harus dijenuhkan dulu selama lebih kurang 30 menit dengan bantuan kertas saring. *Penguapan dari fase gerak dari permukaan lempeng, dalam chamber yang tidak jenuh akan menghasilkan Rf yang lebih besar, reproducibility hasil keterulangan Rf tak bagus dan permukaan fase gerak akan konkap. *Fase gerak yang tidak mau campur dengan sempurna akan menghasilkan chamber yang tidak jenuh 5

6 Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatografi) atau KLTKT (kromatografi lapis tipis Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif (butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk analisis kuantitatif Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat digunakan densitometer baik menggunakan pereaksi bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan pelacak sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri) Lempeng 6

7 Teknik penggunaannya : - Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan (hanya untuk TLC dengan pendukung gelas), - Sinar yang diserap dan dipantulkan - Atau sinar yang dipendarkan. Susunan optik densitometer ini tidak banyak berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada densitometer digunakan alat khusus reflection photomultiplier, sebagai pengganti photomultiplier pada spektrofotometer.

8 lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan noda pada KLT secara : Absorpsi Transmisi Pantulan (refleksi) Pemakaian “TLC Scanner (Densitometer)" makin banyak dipakai seiring dengan berkembangnya teknik kromatografi

9 Sumber Radiasi Spektrofotodensitometer memberikan rentang gelombang penentuan nm. Lampu D 2 (Deuterium) digunakan untuk pengukuran pada daerah ultraviolet sedangkan lampu tungsten untuk pengukuran pada daerah sinar tampak. Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi. Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi atau absorpsi dan refleksi pada panjang gelombang maksimal.

10 Pada penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar fluor diukur pada panjang gelombang dimana terjadi emisi atau intensitas relatif pendar fluor yang optimal. Monokromator dipakai monokromator kisi difraksi Detektor PMT (Photo Multiplier Tube = Tabung Penggandaan Foton) merupakan detektor umum yang dipakai pada densitometer.

11 Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang yang merupakan hasil pemisahan dengan KLT. Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair kinerja Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area noda kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zig-zag" menyeluruh.

12 Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan intensitas semula (I 0 ) jatuh pada permukaan lapisan tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut akan: direfleksikan (I s ) diserap oleh analit lapisan tipis (I) diteruskan (I t ). I=I 0 + I s + I t

13 Intensitas REM yang direfleksikan tergantung pada koefisien permukaan lapis tipis (E), yang dinyatakan sebagai : I s = I. E Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat : I 0 =I-I s I 0 =I-I.E=(I-E)I Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan tipis yang homogen maka akan berlaku hukum Lambert Beer seperti pada spektrofotometri. I t =I 0. e - KX

14 E = koefisien permukaan lapis tipis ↓ Hk. Lambeert Beer → I t = I 0. e -kt x= tebal medium lapis tipis k= koefisien absorbsi e -kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik yang melewati medium → “ Optical density ” ↓ Parameter S (koef. Penghamburan) I t =I 0. e - KX

15 Oleh sebab itu pada metode spektrofoto- densitometri dikenal parameter : K (koefisien absorbsi) S (koefisien penghamburan). Oleh karena adanya parameter S (koefisien penghamburan) inilah terjadi penurunan intensitas radiasi yang masuk medium lapis tipis yang dihamburkan oleh partikel-partikel fase diam.

16 Parameter S (koef. Penghamburan) Menyebabkan penurunan I radiasi yang masuk ke medium lapis tipis Sx = tiap pelat berbeda harganya = dl dx = + (S + K ) I + S j - = - (S + K ) I + S j dl dx +

17 Bagan Alat densitometer Gambar

18 PM Lempeng T S Mk PM IIIIIIII ( a ) S Mk PM PS PM Lempeng ( b ) Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)

19 Cara Kerja Densitometer Lempeng yang telah digunakan untuk pemisahan. diuji dulu kedudukan setiap bercak pada sumbu(X, Y). agar sinar dapat tepat mengenai pusat bercak. Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempat kan pada satu garis deretan Y, bercak diatur, dan gerakan lempeng diatur sesuai kedudukan bercak, menggunakan mikrokomputer. Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan secara maksimum, bila belum diketahui dilakukan scanning lebih dulu.

20 Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara : A. Cara memanjang Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga bercak hanya dideteksi sepanjang garis tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2). Hasilnya baik bila bercak berbentuk bulat semetris. B. Sistem zig-zag Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu Y tetapi berbelok -belok sampai garis tepi bercak pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan X1- X2.

21 Pelacakan bercak, Gambar. Cara pelacakan bercak dengan TLC Scanner (a) Model zig-zag. ( b). model lurus Kelebihan penggunaan metode zig-zag lebih merata pengukurannya, apalagi delta Y menggunakan jarak terkecil. Kelemahannya waktu lebih lama, tetapi ketelitian pengukuran lebih terjamin dibanding penggunaan metode pengamatan lurus.

22 Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas area (mikro volt) yang tertera merupakan besaran puncak. Kadang-kadang prosentase yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari puncak yang muncul (tergambar). Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak semitris akan kurang teliti sebab konsentrasi terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak bercak. Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan molekul senyawa untuk mengumpul ditengah lebih banyak.

23 Analisis Kualitatif Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan waktu retensinya, atau dilakukan penyarian dari bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji secara spektroskopi. Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya dapat diuji. `

24 Cara Ekstraksi Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar UV diberi tanda (lingkari) dengan ujung pensil, kemudian diambil lapisan tipis bersama bercaknya. Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas piala, ditambah pelarut yang sesuai (etanol/ kloroform), diaduk, dan setelah larut, disaring. Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume sampai tepat tanda ( 10,0 ml). Larutan siap diuji dengan alat spektrofotometer.

25 Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer pada panjang gelombang serapan maksimumnya. Karena pengenceran merupakan faktor penting untuk perhitungan kadar senyawa yang diuji secara kuantitatif segala caranya,

26 TLC Plate HPTLC Plate

27

28 TLCHPTLC Plate particle size: µm5 - 7 µm Separation distance: mm60 mm Development time: min min Application:manualautomated/semi- automated Development:manualautomated Derivatization:sprayingdipping Analysis data:no documentationfully documented Quantitative analysis:noyes Environment:no controlno problems Resolution:often poorvery good Procedure:flexiblefully standardized Reproducibility:impossiblehighly attainable cGMP Compliant:usually notYES!! Perbedaan TLC dan HPTLC

29 Thin Layer chromatography (TLC) Absorpsi radiasi UV proporsional (sebanding) dengan konsentrasi analit Menghitung kadar (kuantitatif) mungkin untuk dilakukan

30 Example: anthraquinone derivatives Singh et al., J. Chromatogr. A, 1077 (2005) RP-18 thin layer methanol – water – formic acid 80:19:1 (v/v/v) UV-densitometry at 445 nm CompoundR 1 R 2 1.PhyscionHOCH 3 2.ChrysophanolHH 3.EmodinHOH 4.ChrysophanolGlcH Glycoside 4 major anthraquinone derivatives found in a species of indian rhubarb Varied bioactivities (antioxidant, antifungal, antimicrobial, antiviral, etc)


Download ppt "KLT-Densitometer. TLC (Thin Layer Chromatography) Pengembangan versi modern dari kromatografi kertas Kertas diganti oleh lapisan fasa diam (silika gel,"

Presentasi serupa


Iklan oleh Google