KINETIKA MIKROBA DAN FERMENTASI Tri Mulyani Rudi Nurismanto Program Studi Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Industri Universitas Pembangunan Nasional “Veteran” Jawa Timur

KINETIKA PERTUMBUHAN MIKROBA Kecepatan produksi sel (biomassa) Pengaruh lingkungan terhadap kecepatannya

Parameter –parameter pertumbuhan Kecepatan pertumbuhan spesifik atau waktu penggandaan Growth yield Metabolic quotient utk penggunaan substrat dan pembentukan produk Affinitas substrat Jumlah maksimum biomassa

Pengamatan kinetika pertumbuhan Sistem dinamik (batch culture system) Sistem kontinyu (steady state system)

1. KECEPATAN PERTUMBUHAN Persyaratan pertumbuhan mikroba Inokulum yg masih hidup dan aktif Sumber energi Nutrisi Tidak ada inhibitor Kondisi fisiko-kimia yg cocok Dalam suatu interval waktu yg sangat singkat (dt), terjadi kenaikan jumlah biomassa (dx) yg proposional dengan jumlah biomassa yg ada dx = µ x dt x= jumlah biomassa atau sel t = waktu dx/dt = Kecepatan pertumbuhan populasi µ x = Kecepatan pertumbuhan spesifik dx/dt = µ x

Bila µ konstan, integrasi persamaan (2) menghasilkan  ln x = ln x0 + µ.t Dimana x0 adalah jumlah biomassa pada t = 0 , dan x adalah jumlah biomassa setelah waktu t. Apabila dilukiskan dgn grafik hubungan antara waktu dgn ln x, maka diperoleh suatu garis lurus dengan slope sebesar µ. Persamaan (3) bila menggunakan logaritma maka diperoleh persamaan Juga dapat diubah menjadi log x = log x0 + ( µ. t/2.303) ln (x/x0) = µ.t atau x = x0 eµ.t  pertumbuhan logarimik/eksponensial

Microbial Growth Kinetics Microbial Growth Kinetics describe how the microbe grows in the fermenter. This information is important to determine optimal batch times. The growth of microbes in a fermenter can be broken down into four stages: Lag Phase Exponential Phase Stationary Phase Death Phase (Growth curve is from Shuler p. 161)

Microbial Growth Kinetics Lag Phase This is the first phase in the fermentation process The cells have just been injected into a new environment and they need time to adjust accordingly Cell growth is minimal in this phase.

Microbial Growth Kinetics Exponential Phase The second phase in the fermentation process The cells have adjusted to their environment and rapid growth takes place Cell growth rate is highest in this phase

Microbial Growth Kinetics Exponential Phase (Continued) At some point the cell growth rate will level off and become constant The most likely cause of this leveling off is substrate limited inhibition Substrate limited inhibition means that the microbes do not have enough nutrients in the medium to continue multiplying.

Microbial Growth Kinetics Stationary phase This is the third phase in the fermentation process The cell growth rate has leveled off and become constant The number of cells multiplying equals the number of cells dying

Microbial Growth Kinetics Death phase The fourth phase in the fermentation process The number of cells dying is greater than the number of cells multiplying The cause of the death phase is usually that the cells have consumed most of the nutrients in the medium and there is not enough left for sustainability

Hubungan antara kecepatan pertumbuhan spesifik (µ) dgn waktu penggandaan (td) atau waktu generasi biomassa dgn ketentuan x = 2 x0 dan t = td ln (x/x0) = µ t  ln 2 = µ td  0.693 = µ td atau td =0.693/µ

Derajat multiplikasi adalah x/x0 = e µ t , banyaknya penggandaan (n) dari suatu biomassa x/x0 = 2n Atau n = 3.32 log (x/x0)

Dalam pertumbuhan dg selang waktu t telah terjadi penggandaan biomassa sebanyak t/td kali x = x0 2 t/td log 2 x = log2 x0 + (1/td) t Pada grafik, persamaan di atas menunjukkan hubungan antara log2 x dengan waktu t, dg slope 1/td atau kebalikan dr waktu penggandaan.

Beberapa peneliti lebih menyukai menggunakan 1/td (kecepatan pertumbuhan) sedang yang lain menggunakan µ (kecepatan pertumbuhan spesifik ). Namun µ lebih baik karena kejadiannya sesuai dg hukum pertumbuhan yang mendasar dan dapat diterapkan pada sistem kontinyu. Hukum pertumbuhan yg logaritmik berlakku bila kondisi lingkungan maupun konstituen biomassa tidak berubah.

2. Growth Yield merupakan hasil bagi antara perubahan jumlah biomassa dg substrat . Y =  x/ s atau Y = - dx/ds Dimana  x adalah kenaikan jumlah biomassa akibat digunakan substrat sebanyak  s Tanda neg. digunakan karena x dan s berubah dengan arah yang berlawanan. Growth yield merupakan cara untuk menyatakan kebutuhan nutrisi oleh suatu organisme secara kuantitatif. Ada yang menggunakan istilah 1/Y (kebalikan dari growth yield) yang disebut koefisien ekonomi. x – x0 = Y (s0 – s)

Untuk suatu substrat pembatas-pertumbuhan (growth limiting-substrate), bila pertumbuhan mencapai jumlah biomassa maksimum (xm), berarti s hampir sama dg nol (s  0), maka : xm – x0 = Y s0 Bila dilukiskan dengan grafik hubungan antara xm dan s0 akan diperoleh garis lurus dengan slope sebesar Y

Hubungan antara kadar fruktosa dan jumlah biomassa dari Pseudomonas sp Hubungan antara kadar fruktosa dan jumlah biomassa dari Pseudomonas sp. Fruktosa merupakan satu-satunya sumber karbon (growth limiting-substrate), dan besarnya growth ditunjukkan oleh besarnya slope.

3. Metabolik kuosiens (metabolic quotient) Kecepatan penggunaan substrat dalam pertumbuhan pada suatu waktu tertentu ds/dt = q x dimana x = jumlah biomassa Q = metabolik kuosien (kecepatan metabolisme spesifik) metabolisme spesifik analog dengan aktivitas enzim ds/dt = (µ x/Y) atau ds/dt = (µ /Y) x q = (µ /Y)

4. Pengaruh kadar substrat terhadap kecepatan pertumbuhan. Pengaruh kadar substrat terhadap kecepatan pertumbuhan mengikuti konsep kinetika enzim yaitu pengaruh kadar substrat terhadap kecepatan reaksi enzimatis (persamaan Michaelis-Menten) Dimana : V = kecepatan reaksi enzimatis S = kadar substrat Km = konstanta Michaelis-Menten Vmax = kecepatan reaksi maksimum Dalam kinetika mikroba v (kec. Reaksi enzimatis) identik dg q q = qm . s /(s + Ks)

Ks = konstanta saturasi yg equivalen dg konstanta Michaelis-Menten qm = harga q maksimum bila q =  / Y dan qm = m /Y maka  =  m . s /(s + Ks) (persamaan Monod) Kebalikan dr pers Monod 1/  = Ks/ m .1/s + 1/ m

5. Pengaruh zat penghambat pertumbuhan Penghambatan kompetitif Inhibitor berlomba bersama substrate untuk digunakan oleh biomassa X + S  XS X + I  XI XS  P + X Kecepatan pertumbuhan :

Penghambatan non kompetitif X + S  XS X + I  XI XS + I  IXS XI + S  IXS XS  P + X Kecepatan pertumbuhan menjadi

Penghambatan oleh substrat Beberapa substrat tertentu bila jumlahnya berlebihan akan menyebabkan penghambatan, mis. alkohol, fenol dan hidrokarbon. X + S  XS XS + S  XS2 XS  P + X Rumus :  = (s . s . K1)/(sK1 + Ks K1 + s2)

Pengaruh aktivator pada pertumbuhan Senyawa yang tidak digunakan untuk perrtumbuhan dan juga tidak mengalami metabolisme tetapi dapat mempengaruhi kecepatan pertumbuhan, yaitu menaikkan kecepatan maksimum pertumbuhan X + S  XS X + A  XA XA + S  XAS XS  P + X XAS  P + X Kecepatan dengan adanya aktivator  = .m (s/s . Ks) Dimana a = kadar aktivator Ka = konstanta untuk disosiasi XA m = kecepatan pertumbuhan spesifik maksimum tanpa aktivator m1 = kecepatan pertumbuhan spesifik maksimum dengan adanya aktivator

Environmental Factors Temperature pH Salinity Oxygen Concentration

Environmental Factors Extremophiles can tolerate or perhaps require extreme conditions in any of the above. Cellular compensation outside of their optima can reduce growth rate and yield.

Temperature effects on growth rate. Figure: 06-16 Caption: Effect of temperature on growth rate and the molecular consequences for the cell. The three cardinal temperatures vary by organism.

Classifications of microbes according to temperature optima. Figure: 06-17 Caption: Relation of temperature to growth rates of a typical psychrophile, a typical mesophile, a typical thermophile, and two different hyperthermophiles. The temperature optima of the example organisms are shown on the graph.

Classification of microbes according to tolerance of pH extremes Figure: 06-22 Caption: The pH scale. Note that although some microorganisms can live at very low or very high pH, the cell’s internal pH remains near neutrality.

Classification of microbes according to salinity tolerances. Figure: 06-23 Caption: Effect of sodium ion concentration on growth of microorganisms of different salt tolerances or requirements. The optimum NaCl concentration for marine microorganisms such as V. fischeri is about 3%; for extreme halophiles, it is between 15 and 30%, depending on the organism.

Classification of microbes according to their oxygen responses. Aerobic Anaerobic Facultative Microaerobic aerotolerant Figure: 06-25a-e Caption: Aerobic, anaerobic, facultative, microaerophilic, and aerotolerant anaerobe growth, as revealed by the position of microbial colonies (depicted here as black dots) within tubes of thioglycolate broth culture medium. A small amount of agar has been added to keep the liquid from becoming disturbed and the redox dye, resazurin, which is pink when oxidized and colorless when reduced, is added as a redox indicator. (a) Oxygen penetrates only a short distance into the tube, so obligate aerobes grow only at the surface. (b) Anaerobes, being sensitive to oxygen, grow only away from the surface. (c) Facultative aerobes are able to grow in either the presence or the absence of oxygen and thus grow throughout the tube. However, better growth occurs near the surface because these organisms can respire. (d) Microaerophiles grow away from the most oxic zone. (e) Aerotolerant anaerobes grow throughout the tube. However, growth is no better near the surface because these organisms can only ferment.

Tipe – tipe Fermentasi Dalam proses fermentasi, terdapat hubungan yang erat antara pertumbuhan sel, hasil akhir, kecepatan pembentukan produk serta konsumsi substrat Tipe-tipe fermentasi Didasarkan atas produk dan pertumbuhan Pertumbuhan sinonim Pembentukan produk dan pertumbuhan sel sama, mis. scp 2. Pertumbuhan associated Pertumbuhan sel diiringi sintesa produk mis. Fermentasi alkohol 3. Pertumbuhan non associated Sintesa produk terjadi setelah pertumbuhan sel selesai mis. Konversi glukosa menjadi 5 ketoglukonic acid oleh Acetobacter suboxidant

Berdasarkan atas produk yg terbentuk Simple nutrient diubah menjadi produk dengan stoichiometri yang pasti, tanpa akumulasi bahan antara (intermediate), mis. Konversi glukosa menjadi asam glukonat oleh Aspergillus niger. Simultan jika lebih dari satu produk yang dihasilkan, dan kecepatannya bervariasi tergantung pada konsentrasi substrat, mis. Konversi gula menjadi cell protein dan cell fat selama pertumbuhan Rhodotorula glutinis. 3. Consecutive terjadi akumulasi hasil antara hingga batas (level) tertentu sebelum hasil akhir terbentuk, mis. Konversi glukosa menjadi asam glukonat oleh Pseudomonas ovalis Stepwise Substrat dikonversikan menjadi bahan antara baru kemudian dikonversikan menjadi hasil akhir (produk), mis. Konversi glukosa menjadi 5 ketoglukonic acid oleh Acetobacter suboxidant

I.1. Growth yield Nilai perbandingan antara sel yang terbentuk dari setiap satuan substrat Yg = Yx/s = dx/ds x= konsentrasi sel s = konsentrasi substrat Untuk memperoleh konsentrasi sel maksimum, dapat ditentukan dengan dua cara : a. growth limiting substrate b. jumlah maksimum sel per satuan volume

a. growth limiting substrate Suatu keadaan dimana pada saat konsentrasi sel mencapai maksimum, kadar substrate akhir  0 xm – x0 = Yx/s . S0 xm = konsentrasi sel maksimum x0 = konsentrasi sel awal Yx/s = growth yield s0 = konsentrasi substrate awal b. Jumlah maksimum sel per satuan volume xm = 10 12/v v= volume sel (m3)

I.2. Metabolic quotient Kecepatan konsumsi substrate dalam fermentasi pada waktu tertentu dinyatakan dalam : ds/dt = qs . x qs = metabolic quotient atau spesific metabolic rate Selama pertumbhan mikroba, substrate yang dikonsumsi dapat dinyatakan dalam persamaan ds/dt = ds/dx . dx/dt sehingga ds/dt = .x / Yx/s dr persamaan di atas diperoleh qs = / Yx/s

I. 3. Hubungan antara product formation rate dan I.3. Hubungan antara product formation rate dan growth rate untuk pertumbuhan associated Persamaan umum untuk pembentukan produk dp/dt = qp . x Produk yg terbentuk sebanding dg biomassa dp = Yp/x . dx Hubungannya dengan kecepatan pertumbuhan dp = Yp/x . x Hubungannya dengan substrate dp = Yp/s . s Spesific rate of product formation dp = Yp/x . 

1.4. Pertumbuhan non associated Pembentukan produk dapat dikelompokkan menjadi 2 tipe, yaitu : a. qp tidak merupakan fungsi dari  mis. Produksi penicillin oleh Penicillium sp pada 0.015/jam b. qp merupakan fungsi dari  yang kompleks mis. Produksi melanin oleh Aspergillus niger, Cyclodexttrin dari pati oleh Bacillus macerans Asam laktat dari gula oleh Lactobacillus sp Persamaan : qp = qp max - k

METODE MENGUKUR PERTUMBUHAN MIKROBIAL Pengukuran banyaknya Sel Perhitungan mikroskopis Penghitungan dengan pupukan cawan petri Kultur slide Cauter counter Nefolometri Mengukur massa sel Metode langsung a. bobot sel kering b. turbiditas

Metode tidak langsung a. komponen sel b. pengambilan nutrient c. pembentukan produk d. Evolusi panas e. volume sel terkemas f . viskositas

Procedure for viable counting using serial dilutions of the sample and the pour plate method

Contoh soal Dalam proses fermentasi untuk memproduksi alkohol, digunakan Saccharomyces cereviceae dengan substrat glukosa secara batch system. Proses dilakukan secara anaerob untuk pembentukan alkohol. Pada awal proses suasananya aerob sehingga terjadi pertumbuhan sel yang cepat hingga tercapai suasana anaerob. Pengamatan dilakukan mulai jam ke 0 sampai jam ke 39 dengan interval 3 jam. Diperoleh data seperti pada tabel di bawah. Pertanyaan : Gambarkan kurva petumbuhan sel dan pembentukan produk tersebut Hitung kecepatan pertumbuhan spesifik () dan doubling time (td) Hitung hasil pertumbuhan (Yx/s) dan Pembentukan produk (Yp/s) Hitung efisiensi produksi alkohol terhadap gula

No. Jam Ke Kadar Sel (mg/l) Kadar Alkohol (%) Kadar Glukosa (g/l) 1 154 1.10 54.7 2 3 468 1.02 53.2 6 813 1.63 48.8 4 9 2.65 47.1 5 12 858 3.15 48.9 15 993 3.05 45 7 18 1225 3.10 38.8 8 21 1270 3.58 34.5 24 1314 3.75 34.1 10 27 - 11 30 1359 4.03 24.7 33 1532 4.30 18.5 13 36 1536 4.12 13.3 14 39 1516 4.35 9.7

Grafik

Kecepatan pertumbuhan spesifik dalam suasana aerob (dianggap tidak ada fase lag)

Kecepatan pertumbuhan spesifik dalam suasana anaerob Suasana anaerob berlangsung mulai jam ke 4 – ke 21 atau ke 24 Dengan persamaan regresi ln (kadar sel) = 6.44 + (0.032 x waktu) Misal dihitung dari jam ke 6 dan jam ke 24 Pada jam ke 6, maka ln (x6) = 6.632 Pada jam ke 24, maka ln (x24) = 7.208

Hasil pertumbuhan (growth yield constant) Yx/s dan Pembentukan produk (product yield constant) Yp/s Dianggap alkohol terbentuk setelah jam ke 3, Pertambahan alkohol berhenti pada jam ke 33 Pada jam ke 3 X = 468 mg/l P = 1.02 % S = 53.2 g/l Pada jam ke 33 X = 1532 mg/l P = 4.30 % S = 18.5 g/l Berat jenis alkohol  S = 53.2 – 18.5 = 34.7  P = 4.30 – 1.02 = 3.28 atau 3.28 x 0.8 = 2.624 g/100ml = 26.24 g/l  X = 1352 – 468 = 1064 mg/l = 1.064 g/l Hasil pertumbuhan Yx/s =  x/S = 1.064/34.7 = 0.0306 Pembentukan produk Yp/s =  P/S = 26.24/34.7 = 0.756

Efisiensi produksi alkohol terhadap gula Efisiensi : perbandingan antara glukosa yang diubah menjadi alkohol dengan glukosa mula-mula selama 39 jam fermentasi Kadar glukosa mula-mula = 54.7 g/l Alkohol yang terbentuk selama 39 jam 4.35 – 1.10 = 3.25 % atau 3.25 x 0.8 = 2.6 g/100 ml = 26 g/l Secara teoritis konversi gula menjadi alkohol 51 % Maka alkohol 26 g/l berasal dari 26/0.51 = 50.98 g/l Efisiensi produksi alkohol terhadap glukosa (50.98/54.70 ) x 100% = 93 %