PENANDA GENA UNTUK TANAMAN

Gen penanda Umumnya diturunkan dari sumber bakteti atau taaman dan dapat dibagi menjadi 2 tipe : (1) selectable marker, (2) screenable marker. Selectable marker adalah penanda yang memungkinkan seleksi sel transforman atau eksplan tanaman, dengan kemampuan mereka dapat tumbuh dalam media yang mengandung antibiotik atau herbisida.

Selectable marker yang sering digunakan adalah kanamisin atau hygromycin. Disamping untuk seleksi transforman marker demikian dapat digunakan untuk mengikuti warisan gen asing dalam populasi tanaman terpisah

Screenable marker, seperti CAT, produk-produk gen penyandi memiliki aktivitas enzim yang dapat dengan mudah diuji, yang memungkinkan tidak hanya untuk deteksi transforman tetapi juga untuk estimasi/ pendugaan tingkat ekspresi gen asing dalam jaringan tanaman trasgenik.

Marker-marker seperti GUS, luciferase atau B-galaktosidase memungkinkan screening aktivitas enzim dengan pewarnaan histokimia atau uji fluorimetrik sel individu dan dapat digunakan untuk studi sel spesifik ,demikian pula ekspresi gen yang diregulasi perkembangan. Secara rutin gen penanda telah dihubungkan dengan promoter yang diturunkan dari pathogen tanaman, T DNA A. tumefaciens atau virus tanaman. Dengan cara ini diharapkan promoter demikian berfungsi secara baik di dalam semua sel tanaman.

Tanaman dengan pendaran warna Gen yang mengkode kemampuan menghasilkan warna pada E. coli adalah GUS (beta-glucuronidase) Kemampuan berpendar pada kunang-kunang dikode oleh LUC (luciferase) Pada ubur-ubur dikode oleh GFP (green fluorescent protein).

Gen GUS GUS (beta-glucuronidase) merupakan enzim yang ditemukan pada bakteri Escherichia coli K-12 Menghasilkan warna jika diinkubasikan dengan sebuah substrat . substrat yang biasa digunakan adalah 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc). GUS banyak digunakan sebagai marker (penanda) atau reporter (pelapor) suatu gen melalui teknik promoter:GUS fusion system pada tanaman. Alasannya sederhana, karena pada tanaman normal (wild type) tidak ditemukan adanya aktivitas GUS. Tujuan dari teknik ini adalah untuk menganalisa aktivitas promoter suatu gen pada organ atau jaringan yang berbeda. Karena ekspresi suatu gen tergantung promoternya

Gus Fussion System pada tanaman normal (wild type) tidak ditemukan adanya aktivitas GUS. untuk menganalisa aktivitas promoter suatu gen pada organ atau jaringan yang berbeda. Karena ekspresi suatu gen tergantung promoternya Untuk mendapatkan ekspresi gen pada tanaman, maka konstruksi promoter: GUS fusion  harus ditransfromasikan terlebih dahulu dan baru dapat dianalisa pada generasi selanjutnya. Setelah mendapatkan tanaman transgenik, maka analisa eskpresi gen melalui GUS assay akan sangat mudah dilakukan dengan prosedur yang sederhana

Ekspresi Gus Penampakan ekspresi GUS tersebut menunjukkan pola ekspresi suatu gen yang bertanggung jawab pada proses di suatu organ atau jaringan tertentu Contoh RIP1 (Rice Immature Pollen 1), gen penting untuk kematangan pollen (serbuk sari) dan germinasi, memiliki pola ekspresi GUS pada bagian spesifik bunga yaitu anther (kepala putik) dan hanya terekspresi pada fase akhir vakuolasi dan fase pematangan pollen

Pemakaian gen GUS pada padi Gambar 1. Pola ekspresi promoter RIP1:GUS. An: anther; O: ovary; Pa: palea

Luciferase dan Cahayanya Enzim yang bisa memendarkan cahaya. Diperoleh dari kunang-kunang ( pada abdomen) Pada bagian ini, enzim luciferase menggunakan luciferin sebagai substrat untuk merangsang pemancaran cahaya. Cahaya yang dihasilkan memiliki panjang gelombang antara 510 sampai 670 nanometer dengan warna pucat kekuningan sampai hijau kemerahan.

Reaksi sangat efisien karena dari total reaksi, 96% diubah menjadi cahaya. Keberhasilan isolasi gen (kloning) luciferase dari kunang-kunang Photinus pyralis pada awal 1980-an oleh Helinski dan Marlene Sama halnya dengan GUS, luciferase juga digunakan untuk analisa ekspresi gen atau sebagai reporter. Luciferase menghasilkan cahaya dengan cara mengoksidasi luciferin dan pada umumnya bersifat ATP-dependent .

Lanjutan ….. Penggunaan luciferase sebagai reporter gen memiliki keunggulan di antaranya luciferin (substrat) yang dipakai bersifat water soluble (larut dalam air) sehingga dapat dengan mudah masuk ke dalam sel. Selain itu, luciferase bisa melangsungkan reaksinya di dalam sel hidup karena produk reaksinya tidak bersifat toxic (beracun) bagi makhluk hidup.   

Lanjutan ……… untuk menyeleksi mutan yang berkaitan dengan stress (cekaman) lingkungan. Sistem ini dibuat dengan menggunakan promoter RD29A (promoter spesifik untuk stress lingkungan) untuk membuat konstruksi RD29A promoter: LUC fusion Dilanjutkan dengan transformasi pada tanaman (Arabidopsis) dan seleksi seedling (semaian) mutan dalam plate atau petridish. Teknik ini cukup efektif dan efisien karena seleksi mutan bisa dilakukan pada fase seedling, setelah perlakuan stress.

Reaksi luminesence oleh luciferase

Luciferin yang digunakan sebagai substrat memiliki konsentrasi 1 mM dan dimasukkan pada botol sprayer yang terlindung dari cahaya (lindungi dengan aluminium foil). Sedangkan perangkat sistem pengambilan gambar terdiri dari detektor (kamera CCD), pengontrol detektor dan komputer. Kamera diletakkan di ruang atau kotak gelap (dark chamber) dengan ukuran 40 x 40 x 55 cm (panjang x lebar x tinggi). Kotak gelap diletakkan terpisah dengan pengontrol detektor. Sampel terlebih dahulu harus disemprot dengan luciferin (substrat) secara merata, kira-kira 4-5 kali semprotan. Dengan cepat sampel diletakkan pada tempat sampel (sample stage) yang berjarak 30 cm dari lensa kamera. Biarkan selama 5 menit sebelum pengambilan gambar ekspresi luciferase. Setelah mengatur fokus pada sampel, maka pengambilan gambar bisa segera dilakukan dan langsung bisa diproses di komputer.

Contoh hasil pemotretan Luciferin Ekspresi luminescence RD29A-LUC pada seedling Arabidopsis (Cold/dingin ; ABA/osmotik ; NaCl / Ggaram ) / D,E,F terekspresi

Tingkat ekspresi luciferase Warna putih-merah menunjukkan ekspresi tertinggi. Warna kuning-hijau menunjukkan ekspresi sedang Biru-hitam menunjukkan ekspresi terendah. Untuk itu jika terlalu banyak ekspresi yang positif, maka sebaiknya dipilih ekspresi tertinggi yaitu warna putih. Dengan teknik ini, beribu-ribu tanaman transgenik bisa dapat segera diketahui dan dipisahkan dari tanaman non transgenik dalam waktu yang sangat singkat.

GFP dan pendaran hijau GFP (green fluorescent protein) merupakan sifat luminescence dengan pendaran warna hijau. Dari ubur-ubur Aequorea victoria Dilakukan pertama kali oleh ilmuwan Jepang Osamu Shimomura pada tahun 1960-an , dilanjutkan oleh Douglas Prasher Keberhasilan kloning tersebut dilanjutkan dengan aplikasi GFP pada dua sistem organisme prokaryotik (bersel tunggal) dan eukaryotik (multi sel/organisme tingkat tinggi)/ Escherichia coli dan nematoda (cacing gelang) yaitu Caenorhabditis elegans. Hasilnya sangat memuaskan. Ekspresi GFP cukup stabil pada kedua sistem tersebut

Penggunaan pd. onion epidermal cells B1K1 + GFP BIK1 adalah protein kinase yang bertanggung jawab terhadap resistensi dari infeksi serangan jamur Botrytis cinerea Ekspresi BIK1 terletak pada plasma membran sel (membran sesuai perannya sebagai gen resisten jamur). GFP yang digunakan sebagai kontrol terekspresi pada sitoplasma dan nukleus (Hal ini berkaitan dengan proses infeksi dari kebanyakan jamur yaitu melalui perusakan dinding sel dan membran sel ).

Ekspresi pendaran warna hijau Ekspresi BIK1 terletak pada plasma membran sel (membran sesuai perannya sebagai gen resisten jamur). GFP yang digunakan sebagai kontrol terekspresi pada sitoplasma dan nukleus

KESIMPULAN Ketiga teknik yang telah dijelaskan di atas, masing-masing memiliki beberapa keistimewaan. GUS, LUC dan GFP fusion system telah memberikan inspirasi dengan kemudahannya dalam mendeteksi ekspresi suatu gen. Aplikasinya pada tanaman sangat mudah (dalam mengeksplorasi fungsi suatu gen).