K R O M A T O G R A F I

KROMATOGRAFI Asal : Yunani penulisan dengan warna sudah tidak tepat lagi karena dapat juga dipisahkan senyawa yang tidak berwarna. Prinsip pemisahan : Sampel yang merupakan campuran bermacam komponen dialirkan melewati sistem kromatografi  komponen akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda  terjadi pemisahan. Macam : Kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatogralhy) Khromatografi kolom.

Prinsip Cara pemisahan bahan terlarut dengan memanfaatkan perbedaan kecepatan geraknya melalui medium yang brepori-pori Pemisahan disebabkan karena perbedaan afinitas masing-masing senyawa pada fasa medium diam Medium diam : padatan atau cairan medium bergerak : gas atau cairan

Dasar afinitas Adsorbsi Pertukaran ion pelarutan

Kromatografi Lapis Tipis Thin Layer Chromatography (TLC) Plat bisa dari bermacam bahan, paling aman kaca (kaca bersifat inert/tidak bereaksi  kaca dicuci bersih supaya tidak mempengaruhi gerak solut (zat yang dipisahkan). Macam adsorben Senyawa yang dipisah :Silika gelombang,AluminaMg trisilikat K2SO4,Kiesehlguhr, Hampir semua , senyawa bersifat basis Karotenoid, tokoferol Asam lemak, gliserida, Gula, farmasetika

Sampel: Sampel yang merupakan campuran senyawa yang akan dipisah dilarutkan dalam zat pelarut yang mudah menguap (kloroform). Larutan sampel diteteskan pada plat dengan pipet mikro/syringe (5 – 10 g dari larutan 0,1%) pengeringan tetesan sampel sebaiknya dengan aliran gas N2 untuk mencegah oksidasi. Pengembangan Dilakukan dengan mencelupkan dasar plat TLC yang telah ditetesi sampel dalam sistem pelarut untuk proses pengembangan.

Proses pengembangan: ada 3 cara Pemilihan pelarut berdasarkan like dissolved like  untuk sampel non polar digunakan sistem pelarut non polar Proses pengembangan: ada 3 cara Pengembangan 1 dimensi ( berjalan searah dengan satu macam pelarut) Pengembangan 2 dimensi Sampel diteteskan dipojok kanan bawah (20 x 20 cm)  2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan 1 selesai plat dikeringkan (sebaiknya dengan aliran gas) Kembangkan dengan sistem pelarut kedua putar plat 90o

Senyawa Adsorben Solven (v/v) Asam amino Silica-gel G 96%etanol/air (70/30) Butan-I-ol/asam asetat/air (80/20/20) Mono dan digliserida Kieselguhr-G (Na-asetat), Kieselgurh –G (Na-fosfat ph 5) Etil-asetat/propan-I-ol (63/35) Butan-I-ol/bufer fosfat pH 5 (40/50/10) Lipida netral Silica gel-G PE/Dietil eter/aseton (90/10/1) Cholesterol ester Karbon tetra khlorida/khloroform (95/5) Karotenoid Kieselgurh-G PE/propan-I-ol (99/1) Fosfolipida Kloroform/methanol/air (65/25/4)

Visualisasi dan Identifikasi Tujuan: melihat komponen penyusun yang sudah terpisah setelah proses pengembangan. Cara Visualisasi Dengan uap Iodium, sinar UV khsuusnya jika dipakai adsorben yang mengandung P, dengan menempatkan plat yang telah dikeringkan dalam ruangan yang mengandung uap Iodium  komponen penyusun dalam bentuk bercak (spot) akan berwarna coklat dengan dasar putih.

Kromatografi Kolom Ada 4 macam : Kromatografi adsorbsi Komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. Kromatografi partisi Komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara lap. Cairan tipis pada penyagga padat yang bertindak sebagai fase stasioner dan eluen yang bertindak sebagai fase gerak (mobil). Kromatografi pertukaran ion Memisahkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen ion tersebut yang terikat pada penukaran ion sebagai fase secara selektif akan terlepas/terelusi oleh fase mobil Kromatografi filtrasi gel Kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase pemisah berlangsung seperti perlakuan pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan.

Kromatografi adsorbsi (Solid Liquid Adsorbtion Chromatography) fs (adsorben) : zat padat fm : zat cair Adsorben : Allumina Charcoallarang Silika gel Magnesia K2SO3 Sukrosa Starch (serbuk pati) Sebuk selulosa Zat pelarut : berperan penting dalam elusi elusi terlalu cepat  pemisahan kurang sempurna elusi lambat  waktu retensi terlalu lama kecepatan elusi harus konstan

Pengisian kolom : Harus seragam Setelah adsorben dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dengan vibrator. Adsorben dapat dimasukkan dalam bentuk larutan (slurry) dan partikelnya dibiarkan mengendap. Bagian bawah dan atas isian kolom diberi wol kada (glass wool) dan sintered glass disc untuk menyangga isian. Contoh alat adsorbsi  Aflatoxin  Okratoxin

Kromatografi Partisi Cair-Cair Fs : cairan Fm: cairan  High Performance Liquid Chromatography (HPLC) gas  Gas Liquid Chromatography (GLC) Keunggulan HPLC : Sangat baik untuk senyawa yang stabilitasnya rendah terhadap suhu karena HPLC dilakukan pada t kamar dan senyawa yang volatilitasnya rendah tidak perlu diberi vatisasi untuk menaikkan volatilitas. misal: gula sederhana pada GLC perlu dilakukan derivatisasi  eter Mampu memisahkan senyawa-senyawa yang serupa (resolusi > baik), resolusi GLC dapat diperbaiki dengan kolom yang panjang. Waktu sangat singkat (S’) Presisi sangat tinggi Peka

Sistem normal (normal phase) HPLC ada 2 sistem : Sistem normal (normal phase)  fs nya cairan polar air dengan penyangga padat silica gel Sistem fase terbalik/reversi/reverse phase Fs : benzene (non polar) penyangga padat : bubuk karet. Filter : untuk mencegah kontaminasi f.mobil  fm bisa dipakai lagi setelah redistilasi untuk menghilangkan gas (adanya gas dapat mengganggu aliran f.mobil) Pompa : untuk membantu aliran penurunan pulsa : agar aliran tidak berdenyut tidak ada sampel  rekorder harus menghasilkan garis datar (base line)

Kromatografi partisi Senyawa Solven (v/v) Asam amino Butan-1-ol/asam asetat/air (40/10/50) Butan-I-ol/piridin/air (33/33/33) Mono dan digliserida Butan-I-ol/piridin/air (50/28/22) Khlorofil Propan-I-ol/PE (4/96) Khloroform/PE (30/70)

Selamat belajar

Standar internal : timbangan akurat Standar yang digunakan langsung dicampur dengan sampel yang akan dipreparasi.  proporsi antara standar dan sampel tetap.  Diperoleh kromatogram  diukur tinggi puncak/luas area L komponen X Berat standar Kadar komponen (% berat) =  X 100% F X L standar X Berat sampel Respon detektor sampel F = konstanta =  Respon detektor standar Luas Respon detektor =  = A/ Berat

Visualisasi dan Identifikasi Tujuan: melihat komponen penyusun yang sudah terpisah setelah proses pengembangan. Cara Visualisasi Dengan uap Iodium, sinar UV khsuusnya jika dipakai adsorben yang mengandung P, dengan menempatkan plat yang telah dikeringkan dalam ruangan yang mengandung uap Iodium  komponen penyusun dalam bentuk bercak (spot) akan berwarna coklat dengan dasar putih. Dengan charing : penyemprotan plat yang telah dikembangkan dengan larutan H2SO4/K2Cr2O7 panaskan pada t = 125oC, zat-zat organik akan teroksidasi menjadi karbon yang berwarna hitam.