K R O M A T O G R A F I

Tujuan Pemisahan Cara-cara pemisahan Menghilangkan konstituen pengganggu Mengisolasi atau memekatkan konstituen yang dikehendaki sebelum dilakukan identifikasi atau pengukuran jumlahnya Cara-cara pemisahan Kristalisasi Sublimasi Penyulingan Penyaringan Sentrifugasi Kromatografi

KROMATOGRAFI Asal : Yunani “Penulisan dengan warna”  sudah tidak tepat lagi, karena dapat juga dipisahkan senyawa yang tidak berwarna. Michael Tsweett (1906)  Pemisahan klorofil dari pigmen-pigmen lain pada ekstrak tanaman menggunakan peralatan berupa kolom gelas yang diisi bubuk kalsium karbonat. Kalsium karbonat  sebagai adsorben Larutan eter yang mengandung ekstrak pigmen (sampel) dituangkan pada bagian atas kolom Kolom dicuci dengan cara menambahkan lagi eter dan dibiarkan mengalir ke bawah  setelah beberapa saat: pigmen yang semula satu warna menjadi beberapa warna yang berurutan dari bagian atas sampai bawah (tampak sebagai zone-zone berwarna) Pigmen yang lebih kuat terserap oleh adsorben menggantikan tempat yang ditempati oleh pigmen yang terserap lebih lemah dan memaksa pigmen yang lebih lemah turun lebih ke bawah

2 macam fase yang berperan dalam pemisahan Prinsip pemisahan : Sampel yang merupakan campuran bermacam komponen dialirkan melewati sistem kromatografi  komponen akan bergerak dengan kecepatan yang berbeda  terjadi pemisahan. Pemisahan dilakukan dengan memanipulasi sedemikian rupa sifat-sifat fisik suatu senyawa atau molekul, yaitu: Kelarutan Absorbsi Volatilitas 2 macam fase yang berperan dalam pemisahan Fase bergerak (mobile phase) : berupa cairan atau gas Fase diam (stationary phase): berupa cairan atau padatan

Macam – macam kromatografi: Berdasarkan jenis fase (fase bergerak & fase diam) yang digunakan Kromatografi gas – cairan Kromatografi gas - padat Kromatografi cairan – cairan Kromatografi cairan - padat Berdasarkan teknik yang digunakan Kromatografi kolom Kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography) Berdasarkan prinsipnya Kromatografi partisi Kromatografi absorbsi Kromatografi pertukaran ion

Kromatografi Lapis Tipis Thin Layer Chromatography (TLC) Plat bisa dari bermacam bahan, paling aman kaca (kaca bersifat inert/tidak bereaksi  kaca dicuci bersih supaya tidak mempengaruhi gerak solut (zat yang dipisahkan). Macam adsorben: Silika gel, Alumina  berperan sebagai fase diam Faktor retensi (Rf)

Sampel: Sampel yang merupakan campuran senyawa yang akan dipisah dilarutkan dalam zat pelarut yang mudah menguap (kloroform). Larutan sampel diteteskan pada plat dengan pipet mikro / syringe (5 – 10 g dari larutan 0,1%), pengeringan tetesan sampel sebaiknya dengan aliran gas N2 untuk mencegah oksidasi. Pengembangan Dilakukan dengan mencelupkan dasar plat TLC yang telah ditetesi sampel dalam sistem pelarut untuk proses pengembangan.

Pemilihan pelarut berdasarkan like dissolved like  untuk sampel non polar digunakan sistem pelarut non polar Proses pengembangan: ada 3 cara Pengembangan 1 dimensi ( berjalan searah dengan satu macam pelarut) Pengembangan 2 dimensi Sampel diteteskan dipojok kanan bawah (20 x 20 cm)  2 cm dari tepi kanan dan dari bawah. Setelah pengembangan 1 selesai plat dikeringkan (sebaiknya dengan aliran gas) Kembangkan dengan sistem pelarut kedua putar plat 90o

Visualisasi dan Identifikasi Tujuan: melihat komponen penyusun yang sudah terpisah setelah proses pengembangan. Cara Visualisasi Dengan uap Iodium, sinar UV khsuusnya jika dipakai adsorben yang mengandung P, dengan menempatkan plat yang telah dikeringkan dalam ruangan yang mengandung uap Iodium  komponen penysusun dalam bentuk bercak (spot) akan berwarna coklat dengan dasar putih. Dengan charing : penyemprotan plat yang telah dikembangkan dengan larutan H2SO4/K2Cr2O7 panaskan pada t = 125oC, zat-zat organik akan teroksidasi menjadi karbon yang berwarna hitam.

Kromatografi Kolom Ada 4 macam : Kromatografi adsorbsi Komponen yang dipisahkan secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian kolom. Kromatografi partisi Komponen yang dipisahkan secara selektif mengalami partisi antara lapisan. Cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak sebagai fase stasioner dan eluen yang bertindak sebagai fase gerak (mobil). Kromatografi pertukaran ion Memisahkan komponen yang berbentuk ion. Komponen-komponen ion tersebut yang terikat pada penukaran ion sebagai fase secara selektif akan terlepas/terelusi oleh fase mobil Kromatografi filtrasi gel Kolom diisi dengan gel yang permeabel sebagai fase pemisah berlangsung seperti perlakuan pengayakan yang didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan.

Kromatografi adsorbsi (Solid Liquid Adsorbtion Chromatography) fs (adsorben) : zat padat fm : zat cair Adsorben : Allumina Silika gel Magnesia K2SO3 Sukrosa Starch (serbuk pati) Sebuk selulosa Zat pelarut : berperan penting dalam elusi elusi terlalu cepat  pemisahan kurang sempurna elusi lambat  waktu retensi terlalu lama kecepatan elusi harus konstan

Pengisian kolom : Harus seragam Setelah adsorben dimasukkan dapat diseragamkan kepadatannya dengan vibrator. Adsorben dapat dimasukkan dalam bentuk larutan (slurry) dan partikelnya dibiarkan mengendap. Bagian bawah dan atas isian kolom diberi wol kaca (glass wool) dan sintered glass disc untuk menyangga isian.

Kromatografi Partisi Cair-Cair Fs : cairan Fm: cairan  High Performance Liquid Chromatography (HPLC) gas  Gas Liquid Chromatography (GLC) Keunggulan HPLC : Sangat baik untuk senyawa yang stabilitasnya rendah terhadap suhu karena HPLC dilakukan pada t kamar dan senyawa yang volatilitasnya rendah tidak perlu diberi derivatisasi untuk menaikkan volatilitas. misal: gula sederhana pada GLC perlu dilakukan derivatisasi  eter Mampu memisahkan senyawa-senyawa yang serupa (resolusi > baik), resolusi GLC dapat diperbaiki dengan kolom yang panjang. Waktu sangat singkat Presisi sangat tinggi Peka

L komponen X Berat standar Standar internal  timbangan akurat Standar yang digunakan langsung dicampur dengan sampel yang akan dipreparasi.  proporsi antara standar dan sampel tetap.  Diperoleh kromatogram  diukur tinggi puncak/luas area L komponen X Berat standar Kadar komponen (% berat) =  X 100% F X L standar X Beratr sampel Respon detektor sampel F = konstanta =  Respon detektor standar Luas Respon detektor =  = A/ Berat

Kesetimbangan Distribusi Distribusi molekul sampel diantara kedua fase ditentukan oleh koefisien distribusi (= koefisien partisi) Cs = kadar molekul sampel dalam fase diam CM = kadar molekul sampel dalam fase bergerak Harga K besar  jumlah molekul yang berada dalam fase diam lebih banyak daripada dalam fase bergerak, dan akan tinggal lebih lama dalam fase diam

Faktor Kapasitas (k ’) : merupakan perbandingan jumlah molekul dalam fase diam dan fase bergerak K = koefisien distribusi Vs = volume fase diam VM = volume fase bergerak Kecepatan alir molekul Kecepatan alir molekul u= kecepatan alir fase bergerak

Waktu retensi (tR) : tR = Panjang Kecepatan Waktu yang diperlukan oleh solut untuk melintas suatu kolom yang panjangnya L tR = Panjang Kecepatan tM = waktu yang diperlukan oleh fase bergerak untuk melintasi kolom tsb K’ = faktor kapasitas

Volume retensi (VR) : tR = waktu retensi F = kecepatan volumetrik fase bergerak Vs = volume fase diam VM = volume fase bergerak

kemampuan suatu kolom untuk dapat memisahkan Resolusi ( R ) : kemampuan suatu kolom untuk dapat memisahkan Resolusi yang baik: R > 1,5  yaitu bila kedua puncak dapat terpisah dengan baik

Resolusi yang baik kadang sulit diperoleh untuk sampel-sampel yang kompleks yang mengandung komponen-komponen yang hampir sama sifatnya atau untuk unsur-unsur yang sangat sedikit (trace) Kromatogram ideal Kromatogram non-ideal

Pedoman memperbaiki resolusi: 1. Memperbesar  tR a. Kolom diperpanjang, L b. Jumlah fase diam diperbesar, Vs c. Manipulasi faktor pemisahan Menurunkan suhu Memilih fase diam yang lebih cocok Memilih fase bergerak yang cocok (bila berupa cairan)

Pedoman memperbaiki resolusi: 2. Memperkecil lebar puncak, W a. Menggunakan fase diam yang lebih kecil ukurannya (halus) atau pengisian ke dalam kolom yang lebih baik (seragam dan kompak) b. Memperbesar luasan interfacial diantara kedua fase c. Memilih kecepatan alir fase bergerak yang optimum d. Mengurangi ruang mati dalam sistem e.Mengurangi jumlah sampel. f. Memperkecil diameter kolom