KROMATOGRAFI KOLOM Rezqi Handayani, S.Farm.,M.P.H., Apt PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PALANGKARAYA

Sejarah

Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis Dilaksanakan dalam suatu kolom yg diisi dg fase stasioner Digunakan cairan sbg fase mobil u/mengelusi komponen sampel keluar dari kolom Kolom digunakan untuk memurnikan senyawa / pemisahan campuran Dapat diterapkan pada skala besar

KROMATOGRAFI KOLOM Penggunaan Umumnya Kelebihan Pemurnian / isolasi senyawa bahan alam / Preparatif untuk analisis kuantitatif (sedikit) Pembebanan: dapat banyak atau jumlah senyawa yang dipisahkan lebih banyak

Kromatografi Kolom Sederhana Bergerak / aliran karena gaya grafitasi ↓ Pemilihan fase diam + fase gerak Kepolaran Pita-pita kromatogram Terbentuk fraksi-fraksi Dianalisis dengan KLT / KK↓

JENIS KROMATOGRAFI KOLOM Kromatografi Adsorbsi, komponen yg dipisahkan scr selektif teradsorbsi pd permukaan adsorben yg dipakai u/bhn isian kolom. Kromatografi Partisi, komponen mngalami partisi antara lapisan cairan tipis pd penyangga padat yg bertindak sbg fase stasioner & eluen yg bertindak sbg fase gerak (mobil). Kromatografi Pertukaran Ion, memisahkan komponen yg berbentuk ion yg terikat pd penukar ion sbg fase stasioner scr selektif akan terlepas/terelusioleh fase mobil. Kromatografi Filtrasi Gel, kolom diisi dg gel yg permeabel sbg fase stasioner, dan pemisahan berlangsung spt proses pengayakan yg didasarkan pd ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.

KROMATOGRAFI ADSORBSI

KROMATOGRAFI ADSORBSI Zat padat sbg adsorben / fase stasioner Alumina & silika gel paling populer Urutan dr kemampuan adsorbsi bsr ke kcl : Alumina Charcoal Silika gel Magnesium Kalium karbonat Sukrosa Starch Selulosa

Kolom kromatografi bekerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal.

Pengisian Kolom fase diam homogen fase diam ukuran sama fase diam bentuk seragam bebas gelembung udara Fase diam Pasir Kapas / glass wool Tehnis : fase diam + pelarut → bubur (fase gerak)

Penggunaan kolom u/memisahkan campuran dari dua senyawa dg membuat larutan jenuh dari campuran menggunakan pelarut yang lebih disukai dalam kolom. Membuka kran penutup untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas Menambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Kmdn kran dibuka kembali sehingga senyawa campuran akan diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar brkt ini:

Selanjutnya ditambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom & cegah sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Kmdn kran dibuka, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom Pelarut dikumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Pelarut mengalir kontinyu, shg tetap ditambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering.

Elusi dalam kolom kromatografi Elusi : proses terbawanya komponen dlm suatu camp, shg ada pemisahan komponen yg dibawa oleh FG dari ujung atas kolom → bawah tR : waktu yg diperlukan oleh komponen untuk bermigrasi sepanjang kolom Vr : volume FG yg dibutuhkan untuk membawa komponen dari titik awal kolom → akhir kolom Solvent Sp E B + E kolom E A + E E D signal tR

Penggunaan kolom Misalnya memisahkan campuran dari dua senyawa yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah hijau. Pertama penutup kran dibuka untuk membiarkan pelarut yang sudah berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak seperti gambar disamping. menamambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom. Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir kontinyu, anda tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga kolom tidak pernah kering.

Perubahan yang mungkin terjadi sejalan perubahan waktu

Kolom kromatografi sederhana (learning kolom)

fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4 Isolasi hasil fraksi dengan KLT Preparatif CHCl3 : MeOH : H2O = 6,5 :2,5:0,4 Isolat yang diambil Profil KLT preparatif di bawah UV 254 nm fase diam silika dan fase gerak = kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm. Identifikasi kemurnian isolat dengan KLT CHCl3:MeOH:H2O= 6,5:2,5:0,4 A: isolat hasil isolasi I B: isolat hasil isolasi II A B Gambar KLT hasil purifikasi pada lampu UV 254 nm. fase diam = silika GF 254 nm, fase gerak= kloroform: metanol: air = 6,5: 2,5: 0,4

Hasil spektra Spektrofotometri UV

TERIMAKASIH