Metabolism of polychlorinated dibenzo-p-dioxins by cytochrome P450 BM-3 and it’s mutant Woro Triarsi Sulistyaningdyah1, Jun Ogawa1, Qing-Shan Li1, Raku Shinkyo2, Toshiyuki Sakaki2,**, Kuniyo Inouye2, Rolf D. Schmid3 & Sakayu Shimizu1,* oleh : 10507034 Martalia W. S 10507037 Rini Hapsari 10507080 Emy Indriastuti Received 29 July 2004; Revisions requested 26 August 2004; Revisions received 15 October 2004; Accepted 15 October 2004

AGENDA PRESENTASI Pendahuluan Tujuan Hipotesis Metodologi Hasil Kesimpulan Implikasi

PENDAHULUAN Sitokrom P450 adalah enzim yang dapat larut dalam air dan terlibat pada proses metabolis. Beberapa contoh sitokrom P450 sebagai berikut: Sitokrom P450cam (CYP101) dari Pseudomonas putida  Sitokrom P450 eryF (CYP107A1) dari actinomycete bacterium Saccharopolyspora erythraea  Sitokrom P450 BM3 (CYP102A1) dari bakteri tanah Bacillus megaterium

Pseudomonas putida   Saccharopoldsdsyspora erythraea 

Bacillus megaterium

Penggunaan CYP

PENDAHULUAN BIOREMEDIASI adalah penggunaan mikroorganisme untuk mengurangi polutan di lingkungan. JENIS-JENIS BIOREMEDIASI Biostimulasi Bioaugmentasi Bioremediasi intrinsik

JURNAL

JURNAL Dilakukan bioremediasi pada PCDD (polychlorinated dibenzo-p-dioxins) oleh cytochrome P450 BM-3 dari Bacillus megaterium dan mutasinya, yaitu AL4V. EKSPERIMEN Produk yang dihasilkan terhidroksilasi pada posisi rantai yang tak bersubstituen, dan berkurangnya toksisitas 10% dari senyawa aslinya.

PCDD (polychlorinated dibenzo-p-dioxins)

TUJUAN EKSPERIMEN Membandingkan aktivitas cytochrome P450 BM-3 dengan AL4V sebagai dekompositor pada bioremediasi PCDD (polychlorinated dibenzo-p-dioxins)

HIPOTESIS Mutasi / rekombinan dari P-450 seharusnya menunjukkan aktivitas bioremediasi yang lebih tinggi dibanding senyawa aslinya

METODOLOGI 1.Preparasi wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V 2. Pengukuran aktivitas katalitik wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V

Preparasi wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V Wild-type P450 BM-3 dan mutan AL4V diekspresikan dalam E.Coli Koloni diambil kemudian ditanam di dalam 96 sumur yang mengandung 200 μL media TB dan100 μg/mL ampicillin Diinkubasi (overnight) pada 37oC 40 μL aliquot dari setiap sumur dimasukkan ke dalam tube yang terdiri atas 2 mL media TB dan 100 μg/mL ampicillin Ditumbuhkan selama 2 jam pada suhu 37oC kemudian selama 6 jam pada 42oC 300 mL kultur sel (OD578nm = 0,8-1) disentrifugasi (4000 rpm) selama 10 menit Diresuspensi dengan menggunakan buffer KH2PO4 (pH 7,4) Wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V

1-monochloro-dibenzo-p-dioxin Pengukuran aktivitas katalitik wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V Dilarutkan dalam etanol 1mM 1-monochloro-dibenzo-p-dioxin (1-MCDD) Dilarutkan dalam dimetil sulfoksida 156 μM 2,3-DCDD 2,3,7-triCDD Dilarutkan dalam aseton 1mM 2,3,7,8-tetraCDD Larutan 1-MCDD Larutan 2,3-DCDD 2,3,7-triCDD Larutan 2,3,7,8-tetraCDD

10 μL dari setiap larutan PCDD Pengukuran aktivitas katalitik wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V 10 μL dari setiap larutan PCDD (10 μM untuk 1-MCDD, 2,3-DCDD, 2,3,7-triCDD, dan 1,56 μM untuk 2,3,7,8-tetraCDD) Dicampurkan dengan 844 μL buffer KH2PO4 100 mM (pH 7,5), 80 μL 12% (w/v) glukosa, 8 μL 13.000 U katalase/mL, 20 μL 761 U glukosa dehidrogenase/ mL, 20 μL larutan enzim (purified) Campuran Diinkubasi pada 30oC selama 2 menit setelah ditambah substrat. + 18 μL NADPH 12 mM shaker (170 rpm) dengan suhu 30oC Setelah 5-120 menit, ditambah 3 mL kloroform/metanol (3:1)(v/v) Fasa Organik Diuapkan melalui evaporator

Konsentrasi akhir PCDDs Pengukuran aktivitas katalitik wild-type sitokrom P450 BM-3 dan mutan AL4V Residu Dilarutkan dengan asetonitril Dianalisis dengan menggunakan HPLC Sampel dielusikan dengan gradien linier 20-100% (v/v) asetonitril dalam larutan yang terdiri dari 0,01%TFA selama 25 menit, diikuti 100% aseonitril selama 10 menit, dan 20% (v/v) asetonitril selama 8 menit FR=1mL/menit λ = 227 nm Temperatur kolom = 40oC Konsentrasi akhir PCDDs

HASIL

HASIL

HASIL

KESIMPULAN Subtituen Klorida berbanding terbalik dengan aktivitas P450 Bakteri yang telah dimutasi (Al 4 V) dapat menjadi katalis dalam mendetoksifikasi tanah yang terkontaminasi PCDD. Aktivitas AL4V 2-12 kali lebih tinggi daripada WT sitokrom P450 BM-3 dalam hal mendekomposisi berbagai substrat yakni 1-MCDD, 2,3-DCDD, dan 2,3,7-triCDD

IMPLIKASI Bioremediasi Sebagai aktivator pada clopidogrel

DAFTAR PUSTAKA http://www.springerlink.com/content/g24t81p273352646/ http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T21-4299Y2J-F&_user=3278845&_coverDate=02/09/2001&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000060167&_version=1&_urlVersion=0&_userid=3278845&md5=3d0d363ba6 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1521-3765(20000502)6:9%3C1531::AID-CHEM1531%3E3.0.CO;2-D/pdf http://www.mdidea.com/products/herbextract/echinacea/data.html

Terimakasih..