Teori Zona Difusi Antibiotik DR. Pingkan Aditiawati

Difusi Formula yang berbeda digunakan untuk: a. Mempertahankan konsentrasi antibiotik tetap konstan pada reservoir. b. Pemberian formula dengan jumlah tertentu akan menghasilkan penurunan konsentrasi setelah difusi dimulai. Penggunaan formula yang tepat pada kasus (b) lebih mudah daripada kasus (a). Difusi diluar bagian tepi zona hambat akan berhenti pada kedua kasus diatas (a dan b) karena setelah waktu kritis (critical time), populasi kritis (critical population) yang dicapai akan menyerap fresh antibiotic.

Difusi Jika antibiotik ditambahkan pada reservoir h jam setelah inkubasi dimulai, maka periode pra-inkubasi akan mengurangi waktu difusi. T = T0 – h , dimana T = waktu difusi T0 = waktu inkubasi hingga terjadi pertumbuhan, dimana terbentuk tepi zona hambat Pra-difusi ( -h ) dibawah suhu inkubasi yang memungkinkan untuk pertumbuhan, akan menghasilkan 2 periode difusi, yang masing-masing dikontrol dengan koefisien difusi ( D ) yang berbeda, yaitu: D1 = koefisien difusi pada saat suhu rendah pada h jam D2 = koefisien difusi pada suhu inkubasi pada T0 jam

Pertumbuhan dan Multiplikasi Waktu kritis Inokulum

Waktu Kritis Pertumbuhan populasi merupakan hal yang paling penting untuk diperhatikan dalam hal absorpsi dan kerja dari antibiotik. Kecepatan sintesis reseptor untuk antibiotik merupakan faktor pembatas dari kerja antibiotik. Pertumbuhan populasi yang terus meningkat bergantung pada kecepatan metabolisme. Pada umumnya, adanya penghambatan menunjukkan adanya pencegahan multiplikasi individu organisme. Waktu kritis ( T0 ) antara dimulainya pertumbuhan dengan pembentukan tepi zona hambat merupakan jumlah generasi atau doubling time (n’), serta ditambah periode lag /L( pada awal pembelahan sel setelah waktu ke-0 dan selama metabolisme yang sempurna telah dimulai pada waktu tersebut). Kecepatan pertumbuhan pada umunya dipengaruhi oleh suhu. Contoh: pengaruh suhu pada streptomisin dalam pembentukan zona hambat.

Inokulum Keadaan dan jumlah inokulum merupakan dasar yang penting dalam menentukan waktu kritis saat tepi zona hambat dibentuk. Beberapa faktor yang cukup kompleks mempengaruhi keadaan inokulum, seperti kematian dan pertumbuhan kriptik. Keadaan dan jumlah inokulum dipengaruhi oleh perubahan nutrisi pada medium, dimana organisme diinokulasi dari satu medium ke medium lain. Selain itu pengaruh yang berbeda pada periode lag dalam sintesis RNA, protein atau DNA, dan dalam pembelahan sel akan mengakibatkan hasil yang berbeda dengan pengaruh sintesis antibiotik yang berbeda.

Adsorpsi Penghitungan jumlah populasi penghambat penyerap streptomisin menentukan resting cell staphylococcus. Nilai Nn = 1,36 X 108 berkorelasi dengan penyerapan 6,7 X106 mol streptomisin per sel. Perhitungan yang sama dari populasi kritis untuk penyerapan adalah 2,3 X 107 mol per sel (N’ = 3,85 X 107) selama pertumbuhan logaritmik. Kesulitan dalam pengujian penghitungan tersebut adalah kesulitan dalam percobaan menentukan nilai populasi kritis dan penyerapan antibiotik oleh sel dalam kondisi yang stabil. Rasio konsentrasi kritis terhadap konsentrasi minimum penghambatan (m’/C) juga sulit ditentukan dalam keadaan yang stabil.

Adsorpsi Bagaimanapun kesalahan dalam percobaan sulit ditentukan. Pada gambar disamping menunjukkan nilai yang diperoleh untuk C dan m’ pada strain yang berbeda  Streptococcus viridans diuji dengan penisilin pada kultur permukaan (surface culture)

Adsorpsi Kombinasi pengaruh pH dan konsentrasi Mg 2+ pada m’ dapat dilihat pada kurva disamping ini. Dapat dilihat konsentrasi kritis ditentukan dengan difusi streptomisn pada agar perbenihan.

Mekanisme kerja Antibiotik dapat dirusak atau menyimpang dari mekanisme kerja yang spesifik. Spesifisitas kerja yang berbeda ditunjukkan dalam campuran antibiotik dengan hasil kuantitatif yang berbeda pada organisme yang berbeda (contoh: penisilin pada Staphylococcus dan Bacillus). Mekanisme kerja secara sinergis, aditif, dan antagonis tergantung pada mekanisme kerja yang berbeda. Penisilin yang bekerja pada sintesis dinding sel, hanya efektif pada perbanyakan organisme dan dapat dibuat tidak efektif dengan bakteriostatis yang dihasilkan oleh substansi penghambat lainnya. Streptomisin memerlukan aktivitas metabolik untuk mekanisme kerjanya. Tahapan penting agar antibiotik dapat bekerja pada sel adalah penyerepan antibiotik dengan segera pada sel reseptor.

Pengujian Metode pengujian dasar Formula difusi Kemiringan pada garis pengujian Ketajaman bagian tepi zona hambat Presentasi grafik pembentukan tepi zona hambat

Prinsip Metode Pengujian Zona penghambatan antibiotik telah digunakan secara luas untuk memperkirakan kerja beberapa antibiotik pada seluruh tahapan isolasi dan purifikasi antibiotik baru (dari produk mentah biologi hingga memperkirakan aktivitas zat kimia yang murni). Tanpa pengetahuan faktor biologi yang mempengaruhi suatu uji,maka tidak ada perkiraan variasi statistik yang memungkinkan (yang dapat membuktikan validitas suatu uji). Respons biologi (U) diperkirakan secara langsung dengan mengukur lebar zona penghambatan yang dihasilkan antibiotik. Dosis (Z) merupakan konsentrasi antibiotik pada kondisi pengujian, U=F(Z)

Jika kondisi yang mempengaruhi aktivitas antibiotik sangat terkontrol, pada sampel dan standar sama, sehingga diperoleh fungsi yang identik untuk dibandingkan: Standar Us =F(Zs) Uji Ur =F(Zr) Rasio respons Ur / Us digunakan untuk menghitung rasio dosis Zr / Zs (jika Zs diketahui, Zr maka dapat diuji) Metode paling sederhana yang dapat dicapai dalam perhitungan ini adalah menggunakan fungsi yang menghasilkan garis lurus, dimana terdapat hubungan antara respons dan dosis (dimana fungsi identik dan garis yang diplot akan paralel)

Formula Difusi Kasus paling sederhana yang terjadi dalam reservoir besar  dimana konsentrasi m0 antibiotik yang bersentuhan dengan kultur agar selalu konstan selama periode pembentukan zona penghambatan. Hubungan garis lurus antara ln m0 dan X2 yang benar (dalam batas kesalahan percobaan),akan menghasilkan m0 beberapa kali lebih besar daripada m’, dan X adalah jarak difusi bukan diameter zona penghambatan. Untuk antibiotik yang lemah, hanya dapat diperoleh dalam konsentrasi rendah dibawah konsentrasi kritis, dan saat X kecil, hubungan garis lurus yang diperoleh akan lebih baik dengan memplot X (daripada X2 ) terhadap log m0 . Pada kondisi ini aliran air dan mengembangnya agar menjadi deviator yang penting.

Kemiringan Garis Uji Dengan konsentrasi antibiotik yang konstan dalam reservoir kemiringan garis lurus yang ditunjukkan dengan memplot ln m0 terhadap X2 ditentukan oleh D dan T.Untuk uji yang valid akan menghasilkan garis paralel DT yang konstan dan sama untuk standar dan pengujian. Keakuratan waktu awal inkubasi dan penambahan antibiotik adalah hal yang diperlukan. Selain itu perlakuan yang sama antara standar dan sampel uji juga penting dalam desain pengerjaan dasar statistik. Standarisasi kondisi inokulasi juga merupakan hal yang penting. Ukuran inokulum (N0), periode lag dalam pembelahan sel (L), waktu generasi (G), seluruhnya mempengaruhi nilai T, dan kemiringan kurva uji. Ketersediaan oksigen merupakan faktor yang sangat penting, pada beberapa organisme uji dan antibiotik gagal menghasilkan zona hambat yang tajam dalam keadaan mikroaerofilik. Saat terdapat enzim destruktif, seperti penisilinase yang dihasilkan organisme uji, ukuran inokulum sangat mempengaruhi ukuran zona hambat.

Ketajaman Bagian Tepi Zona Hambat Keakuratan suatu uji sangat jelas tergantung pada keakuratan pengukuran lebar zona hambat yang dapat diukur. Jarak antara dua titik dapat dibaca dengan akurat dengan bantuan sistem yang baik. Pada reservoir kecil (cakram dengan diameter 5 mm) pada banyak formula difusi menggunakan pengukuran ( r ) dari bagian tengah daripada dari bagian tepi reservoir (X). Kesulitan dalam memperkirakan tepi zona hambat (50% penghambatan) akan menurunkan keakuratan uji.

Faktor yang diketahui mempengaruhi ketajaman dan jarak penglihatan bagian tepi zona hambat. adalah: 1. Rasio konsentrasi reservoir terhadap konsentrasi kritis 2. Penggunaan terbatas antibiotik dalam reservoir menghasilkan konsentrasi maksimum pada saat sebelum bagian tepi zona hambat terbentuk 3. Peningkatan waktu difusi menurunkan gradien konsentrasi saat terbentuknya bagian tepi zona hambat. 4. Waktu kritis dan seluruh faktor mempengaruhi n’ dan G. Hal terpenting adalah suhu dan ukuran inokulum (rasio N0/N’). 5. Pertumbuhan dan opacity-nya setelah pembentukan zona hambat sebelum zona hambat diukur. Hal ini tergantung pada komposisi medium dan atmosfer. 6.Penyebaran sensitivitas antibiotik individu organisme pada populasi terhadap antibiotik.

Presentasi Grafik Pembentukan Tepi Zona Hambat Pada gambar disamping grafik kurva hiperbolik peningkatan konsentrasi dengan jarak waktu yang berbeda-beda dari reservoir. Konsentrasi dalam skala logaritma. Setengah bagian terbawah menunjukkan tiga kurva pertumbuhan organisme. Garis horizontal menunjukkan populasi kritis. Kemiringan garis merupakan faktor dalam menentukan ketajaman bagian tepi zona hambat.

METODE KHUSUS Double and triple layer plates Penggunaan layer(lapisan) pada agar di bagian bawah dan atas (yang tidak diinokulasi), dan lapisan yang diinokulasi (lapisan pertumbuhan) dibuat tipis. Inokulasi permukaan Pemanasan kultur Membunuh inokulum dengan pemanasan menurunkan penyebaran variabel, seperti sensitivitas dan waktu generasi individu sel dalam populasi. Spora Penggunaan suspensi spora (pada organsime vegetatif) sangat reproduktif. Fungsi waktu generasi ditambahkan pada awal priode lag. Harus diingat faktor yang mempengaruhi germinasi (nutrisi, suhu, sebelum perlakuan) akan berbeda dengan faktor yang mempengaruhi pertumbuhan vegetatif. Faktor-faktor tersebut harus dikontrol dan dibuat seiidentik mungkin untuk standar dan pengujian.

UJI SENSITIVITAS Kondisi dan Intepretasi Ketidakcocokan antara uji sensitivitas pada beberapa laboratorium sering terjadi. Penggunaan cakram standar, medium, dan teknik bersamaan dengan kontrol sensitif dan strain yang resisten pada kondisi yang sama memungkinkan hasil yang konsisten, sehingga memerlukan peneltian. Gradient Plates Gradient plates telah digunakan dengan berbagai variasi modifikasi untuk menentukan konsentrasi antibiotik  menunjukkan perbedaan yang kecil pada beberapa kultur. (Lihat gambar di bawah ini)