PENGANTAR KROMATOGRAFI Oleh: Purwadi, M.Si. UNIVERSITAS TULANG BAWANG, 2009

Bachelor of Science in Chemistry, University of Lampung, 1999 Purwadi, S.Si. M.Si. abuaidhan@yahoo.com Graduated from: Master of Science with Cume Laude, School of Pharmacy - Institut Tecnology of Bandung, 2007 Bachelor of Science in Chemistry, University of Lampung, 1999 Office: NQCLDF in Bandar Lampung, Deputy of Technical Manager - Testing Laboratoria for Therapeutics, Narcotics, Traditional Drugs, and Complement Product Supervisor for Cosmetic and Forensic testing Laboratory

Competence for: Gas Chromatography High Performance Liquid Chromatograpy UV/Vis Spectrophotometry Spectrophotodensitometry Spectrofluorometry Validation of Analysis Method ISO/IEC 17025-2005: Management & Technical Prerequirement for Testing Labotorium

Materi : 14 kali Ujian : 2 kali (UTS & UAS) Total : 16 kali Metode Belajar: Ceramah Diskusi Tugas Kehadiran mahasiswa minimum 75% Keterlambatan maximum 15 menit Mahasiwa diharap aktif mencari literatur,bertanya dan diskusi

Metode Pemisahan Ilmu Pemisahan (Sparation Science): Ilmu yang mempelajari gejala fisika dan kimia yang terlibat dalam proses /pencapaian pemisahan, pengembangan & penggunaan berbagai proses pemisahan. Definisi Pemisahan menurut Karger: Cara kerja / pengerjaan sehingga suatu campuran dibagi menjadi sekurang-kurangnya 2 fraksi yang berbeda susunannya.

Definisi Pemisahan menurut Rony: Kondisi hipotetik di mana setiap komponen kimia terisolasi sempurna dalam daerah makroskopik yang terpisah Hipotetik karena tidak mungkin mengisolasi komponen suatu campuran secara sempurna.

Teknik Pemisahan Ekstraksi Pelarut Pengendapan Kopresipitasi Elektrodeposisi Pertukaran ion Adsorbsi/desorbsi Volatilisasi (destilasi, sublimasi, dll) Absorbsi

i. Kromatografi, mekanisme: > adsorbsi > Partisi > pertukaran ion > eksklusi > pengayakan molekul > afinitas Dialisis Elektroforesis ultrasentrifugasi 10000 15000 20000

Cara memilih Teknik pemisahan Pilih langkah terbesar pada step pertama jika mungkin termurah. Misal ekstraksi pelarut Pilih proses pemisahan yang didasarkan pada perbedaan sifat fisika. Misal muatan (pertukaran ion), ukuran (filtrasi gel, sentrifugasi) Pilih proses dimana mengeksploitasi perbedaan terbesar sifat fisika antara analit/produk dengan matriks/pengotor Pilih langkah termahal pada saat terakhir, misal hplc

Tujuan Pemisahan kimia: 1. Telaah Fitokimia -struktur Bahan alam simplisia Penapisan fitokimia Ekstraksi Ekstrak Fraksinasi Fraksi Pemisahan/ pemurnian Isolat Karakterisasi & Identifikasi Struktur kimia

2. Isolasi Senyawa Model /Lead Compound - biasanya punya efek - tidak harus dominan Bahan Baku sediaan Hasil ekstrak dapat digunakan untuk membuat sediaan 4. Uji farmakologi  pada hewan coba

Bahan alam Simplisia Ekstrak Uji efek Fraksi Fraksi Sub-fraksi Sub-fraksi Sub-fraksi Sub-fraksi Uji efek Isolat Isolat Isolat Isolat Uji efek

Dalam teknik pemisahan, selalu terdapat fase-fase : Kecuali : elektroforesis dan ultrasentrifugasi hanya melibatkan satu fase.

Nama fase dalam beberapa metode pemisahan Metode Fase 1 Fase 2 Kromatografi Diam Gerak Eksraksi Cair-Cair Rafinat Ekstraktan (yang sudah ada) (yang ditambahkan) Dialisis Retentat Difusat/dialisat (di tabung) (yang didialisa)

Penggolongan Metode Pemisahan A. Berdasarkan Wujud Fase Fase 1 Fase 2 keterangan Gas Cair Padat Difusi termal Krom. Gas-Cair Krom. Gas-Padat Destilasi Krom. Cair-Cair, Ekstraksi, dialisis, ultrasentrifugasi. Krom. Cair-Padat, pengendapan, elektrodeposisi, kristalisasi, pemebrntukan senyawa, inklusi Sublimasi Leaching

dengan Fase 1: fase awal /mengandung cuplikan sendiri Fase 2: fase yang ditambahkan / yang terbentuk

Fase 2 ditambah Fase 2 terbentuk Kromatografi ECC Dialisis B. Berdasarkan asal Fase 2 Fase 2 ditambah Fase 2 terbentuk Kromatografi ECC Dialisis Elektroforesis zona Pengendapan Destilasi kristalisasi Penghabluran

Kontak sinambung Kontak bertahap Kromatografi ECC (Craig) SOKLETASI C. Berdasarkan lama fase berkontak Kontak sinambung Kontak bertahap Kromatografi ECC (Craig) SOKLETASI ECC (corong pisah)

Lintas arus (Cross Current) Lawan Arus (Counter Current) D. Berdasarkan arah fase berkontak Lintas arus (Cross Current) Lawan Arus (Counter Current) ECC (corong pisah) ECC (Craig) diam Lawan arus: pada kenyataannya fase yang satu tidak bergerak, fase yang lain bergerak  lebih tepat disebut lawan arus semu (Pseudo counter current)

Proses mekanis Pengayakan Filtrasi/pengayakan Sentrifugasi E. Berdasarkan jenis proses Proses mekanis Pengayakan Filtrasi/pengayakan Sentrifugasi Proses fisis Krom. Gas-Cair Krom. Gas-Padat Krom Cair-Cair ECC Destilasi, Sublimasi Proses Kimia Pengendapan Krom. Pertukaran ion

Kromatografi Merupakan salah satu teknik pemisahan kimia Berkembang pesat => penemuan perangkat alat baru dan aplikasi baru 3. Dikembangkan untuk analisis kualitatif, kuantitatif, dan preparatif

Definisi Kromatografi Menurut STAHL: Metode fisikokimia untuk memisahkan campuran zat berdasarkan perbedaan waktu huni (residence time) masing-masing zat dalam fase gerak-fase diam Senyawa A lebih dulu keluar karena waktu huni < senyawa B Menurut Martin: Metode Fisikokimia yang memisahkan suatu campuran berdasarkan perbedaan perpindahan linarut dalam fase gerak-fase diam => Senyawa A lebih dulu keluar karena bergerak lebih cepat dari senyawa B

Sejarah kromatografi

Pemakaian Kromatografi: Analitik: = Kualitatif: Mengetahui identitatas suatu analit = kuantitatif : menentukan kadar analit Preparatif: = untuk mendapatkan komponen murni

Penggolongan kromatografi: Berdasarkan fase gerak => kromatografi cair: KLT, KK, KKt, KCKT => Kromatografi gas: KGC, KGP b. Berdasarkan fase diam => kromatografi Cair-Cair: KKt, KCKT => Kromatografi Cair-Padat: KLT, KK, KCKT

c. Berdasarkan penampang fase diam: c. Berdasarkan penampang fase diam: => kromatografi datar / planar: KLT, KKt => kromatografi kolom: KK, KGC, KGP, KCKT

d. Kromatografi berdasarkan proses/mekanisme yang terjadi => Partisi => Adsorbsi => Pasangan Ion => Kromatografi Penukar Ion => size eksklusi => Permeasi gel => Filtrasi gel => afinitas biologi

Teori Kromatografi Pemisahan dalam kromatografi terjadi karena Perbedaan kecepatan migrasi dari berbagai komponen dalam campuran Dengan kata lain, pemisahan terjadi karena perbedaan waktu tambat masing-masing analit dalam fase diam Penyebaran komponen campuran sepanjang fase diam

Sampel campuran Kolom / fase diam Arah aliran fase gerak Analit dengan migrasi paling cepat 29

Mengapa terjadi Perbedaan kecepatan migrasi ? Dalam sistem kromatografi masing-masing analit akan terdistribusi antara fase diam dan fase gerak sehingga membentuk kesetimbangan. Jumlah distribusi analit di antara 2 fase ditentukan oleh konsntanta distribusi (Kd): Kd A = [A]d / [A]g [A]d = konsentrasi analit A dalam fase diam [A]g = konsentrasi analit A dalam fase gerak

Senyawa A lebih lama tinggal dalam fase diam Jika Kd besar konsentrasi analit dalam fase diam lebih besar dari pada dalam fase gerak Senyawa A lebih lama tinggal dalam fase diam KD kecil KD besar

Ada pertanyaan???