JURUSAN FARMASI FKIK UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN Spektrofluorometri Oleh : Hendri Wasito, S. Farm., Apt. (http : // www.hendriapt.wordpress.com)

Tinjauan Umum Penyerapan energi oleh molekul memungkinkan terjadinya : ( Eksitasi, Fluorescensi, dan Fosforescensi) Banyak senyawa kimia memiliki sifat fotoluminensi (dapat dieksitasikan oleh cahaya dan memancarkan kembali sinar dengan panjang gelombang sma atau berbeda dengan semula). Ada dua peristiwa fotoluminensi : (Fluorosensi dan Fosforesensi)

Luminescen Sebagian molekul dalam keadaan ground state berada dalam keadaan singlet. Molekul dalam keadaan : singlet : spin elektron berpasangan triplet : spin elektron tidak berpasangan Energi keadaan triplet sedikit lebih rendah dibanding energi keadaan singlet

Diagram Fotoluminisensi

Deaktivasi molekul tereksitasi Merupakan suatu proses kembalinya molekul yang tereksitasi ke keadaan asas (dari S1 atau T ke S0) : Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) Konversi didalam (Internal Conversion = IC) Pradisosiasi Disosiasi Konversi keluar Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX) Pemadaman sendiri (selfquenching = SQ) Fluoresensi (F) Fosforisensi (P)

Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) Perpindahan energi vibrasi dari molekul yang tereksitasi Molekul yang tereksitasi kehilangan energi eksitasi vibrasionalnya (lewat tumbukan) menjadi keadaan vibrasional S2 Terjadi sangat cepat (10-3) detik Dapat terjadi pada tingkat energi elektronik tereksitasi atau azas

Konversi didalam (Internal Conversion = IC) Perpindahan energi dalam 1 molekul Elektron pindah dari tingkat energi elektronik yang lebih tinggi ke tingkat energi elektron yang lebih rendah tanpa memancarkan sinar (S2  S1 atau T2  T1) Dapat terjadi jika kedua tingkat energi elektronik tersebut berdekatan, sehingga terjadi tumpang tindih diantara tingkat energi vibrasi

Pradisosiasi Kelanjutan IC Perpindahan electron dari suatu tingkat energi elektronik tereksitasi (mis S2) ke tingkat energi vibrasi yang lebih tinggi dari tingkat energi elektronik tereksitasi yang lebih rendah

Disosiasi Putusnya suatu ikatan dalam molekul karena menyerap energi sinar tanpa didahului peristiwa konversi kedalam Elektron ikatan terlepas

Konversi keluar Perpindahan energi elektronik akibat antaraksi molekul yang tereksitasi dengan molekul lain Tidak ada pemancaran sinar Energi yang dipindahkan adalah energi elektronik

Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX) Pembalikan arah spin elektron yang tereksitasi dari tereksitasi SINGLET (S) menjadi TRIPLET (T) dapat mudah terjadi jika tingkat energi vibrasi dari S overlapping dengan tingkat energi vibrasi dari T Terjadi pada molekul dengan berat molekul tinggi

Pemadaman sendiri (selfquenching = SQ) Intensitas fluoresensi berkurang Terjadi akibat tabrakan-tabrakan antar molekul sendiri Adanya pemadam akan menginduksi deeksitasi dari suatu molekul analit yang tereksitasi sehingga tidak ada sinar yang diemisikan Contoh : Oksigen bagi senyawa poliaromatis hidrokarbon

Fluoresensi (F) Pemancaran sinar dari S1  S0 Waktunya amat singkat (10-8) detik Jika eksitasi dihentikan,fluoresensi terhenti Emisi foton sama nilainya dengan energi ang diserap oleh suatu molekul.

Fosforesensi (P) Peroses sutu molekul melangsungkan suatu transisi (emisi) dari tingkat triplet ke tingkat dasar. Pemancaran sinar dari T1  S0 Waktunya lebih lama (10-4 detik) Jika eksitasi dihentikan,fosforisensi masih dapat berlangsung Biasanya didahului oleh L.A.S.

Efesiensi Fluoresensi Bilangan yang menyatakan perbandingan mol yang berfluoresensi dan jumlah total mol yang tereksitasi (min = 0 dan max = 1)

Catatan Indeks : K = Tetapan Laju F = Fluoresensi IC = Konversi didalam EC = Konversi keluar IX = Lintasan antar system PD = Pradisosiasi D = Dissosiasi Faktor Lingkungan = KIC, KEC dan KIX Faktor Struktur Kimia = KF, KPD dan KD

EF dan Jenis Transisi Elektron EF lebih mungkin terjadi pada transisi  *   dari pada *  n karena: Absorptivitas molar transisi  *   jauh lebih besar dari absorptivitas molar transisi *  n Umur eksitasi   * lebih lama dari pada umur eksitasi n   * sehingga Kn  * lebih besar dari pada K  * Kix pada   * lebih kecil dari pada KIX pada n  * , karena energi yang diperlukan untuk pembalikan arah spin pada   * jauh lebih besar dari pada n  *

EF dan Jenis Transisi Elektron Nilai absortivitas molar merupakan kebolehjadian terjadinya transisi, makin besar  makin mudah terjadi transisi  makin mudah terjadi fluoresensi. LAS lebih sulit pada   *, maka   * Fluoresenensi n  *  Fosforisensi

Hubungan Intensitas Fluoresensi (PF) dengan kadar PF adalah proporsional dengan jumlah molekul yang tereksitasi : dimana : PF = Intensitas fluoresensi Qf = Effisiensi fluoresensi P0 = Intensitas yang dikenakan pada sample P = Intensitas setelah mengenai sample

Menurut Hukum Lambert-Beer Jika persamaan 3 dikembangkan dalam suatu seri maka

Pf = (Nilai tetap QF, Po, Σ dan b) c = Kc Jika  bc kecil maka Qf = Effisiensi fluoresensi (nilainya tetap) Po = Intensitas awal (nilainya tetap) Σ = Absorptivitas molar (nilainya juga tetap) b = Tebal kuvet (nilainya juga tetap) Sehingga persamaan menjadi : Pf = (Nilai tetap QF, Po, Σ dan b) c = Kc Jadi intensitas fluoresensi yang terbaca berbanding langsung dengan kadar

Faktor-faktor yang berpengaruh pada fluoresensi 1. Temperatur (Suhu) a. EF berkurang pada suhu yang dinaikkan b. Kenaikan suhu menyebabkan tabrakan antar mol atau dengan mol pelarut c. Energi akan dipancarkan sebagai sinar fluoresensi diubah menjadi bentuk lain misal : EC 2. Pelarut a. Dalam pelarut polar intensitas fluoresensi bertambah, karena dalam pelarut polar b. Jika pelarut yang digunakan mengandung atom-atom yang berat (CBr4, C2H5I) maka intensitas fluoresensi berkurang, sebab ada interaksi gerakan spin dengan gerakan orbital elektron ikatan  mempercepat LAS maka intensitas menjadi berkurang

pH mempengaruhi keseimbangan bentuk molekul dan OH 3. pH pH mempengaruhi keseimbangan bentuk molekul dan ionic λ eks = 285 λ eks = 310 λ em = 365 λ em = 410 Int = 18 Int = 10 Phenol Phenolat 4. Oksigen terlarut Adanya oksigen terlarut dalam larutan cuplikan menyebabkan intensitas fluoresensi berkurang sebab : a. Oksigen terlarut oleh pengaruh cahaya dapat mengoksidasi senyawa yang diperiksa b. Oksigen mempermudah LAS

5. Kekakuan struktur (structural rigidity) Struktur yang rigid (kaku) mempunyai intensitas yang tinggi Bifenil Fluoren EF = 0,20 Adanya -CH2- pada fluoren menyebabkan strukturnya lebih kaku

Hubungan Struktur Molekul dan Fluoresensi Struktur molekul yang mempunyai ikatan rangkap mempunyai sifat fluoresensi karena strukturnya kaku dan planar EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada sistem  dapatmenaikkan intensitas fluoresensi EWG (NO2, Br, I, CN, COOH) dapat menurunkan bahkan menghilangkan sifat fluoresensi Penambahan ikatan rangkap (aromatik polisiklik) dapat menaikkan fluoresensi

Pengaturan pH dapat merubah intensitas fluoresensi, Contoh : Phenol menjadi phenolat  menaikkan fluoresensi Amina aromatik menjadi ammonium aromatik  menurunkan fluoresensi Heterosiklis dengan atom N, S dan O mempunyai sifat fluoresensi Heterosiklis dengan gugus NH, jika medianya asam akan menaikkan intensitas fluoresensi

Komponen fluorometer Sampel cell Excitation filter Transmitted Light (prymary) filter Light source Fluorecent (emitted) light Fluorecence (secondary) filter Phototube Photomultiplier tube

Keuntungan dari analisis fluoresensi Kepekaan yang baik karena : Intensitas dapat diperbesar dengan menggunakan sumber eksitasi yang tepat Detektor yang digunakan seperti tabung pergandaan foto sangat peka Pengukuran energi emisi lebih tepat daripada energi terabsorbsi Dapat mengukur sampai kadar 10-4 – 10-9 M

kelompok analisis obat secara fluoresensi (1) Obat yang mempunyai sifat fluoresensi alamiah dalam hal ini tidak diperlukan tambahan pereaksi Contoh : Quinine Larutan obat ini mengabsorbsi sinar UV dan mengemisi sinar Vis

kelompok analisis obat secara fluoresensi (2) . Turunan obat yang dibentuk dengan pengikatan dengan senyawa berfluoresensi Contoh : Asam amino diikat oleh syclorida [ 5 –(dimethylamino) naphtalene-1-sulfonyl-hloride]  dansyl asam aminoyang intensitas fluoresensinya tinggi SO23CL SO3-NH-CHR-COOH O R=CH-C + - HCL NH2 OH N(CH3)2 N(CH3)2

kelompok analisis obat secara fluoresensi (3) Membentuk molekul berfluoresensi (a. fluorophore) S + - H3C N NH3 CH2-CH2OH.2CL - - - Fe(CN)6 OH CH2 CH3 N N + Vitamin B1 Thiochrome H3C N N S CH2-CH2OH Berfluorensi  eks = 365 nm  em eks = 440 nm N CH3 N

Spektra Eksitasi dan Emisi dari kinin-SO4 1 ppm Secara teoritis spektra eksitasi identik dengan spektra absorsi u.v. Spektra ini dapat digunakan untuk menentukan  spesifik yang menyebabkan timbulnya emisifluoresensi/ fosforisensi dan  yang menimbulkan emisi yang maksimal disebut  eksitasi Spektra emisi adalah duplikat dari spektra eksitasi. Hanya timbul pada  yang lebih panjang.  emisi dipilih suatu  yang menimbulkan intensitas maksimal

Cara memperoleh Dibuat cuplikan dalam pelarut air, etanol, maupun sikloheksan Lar. cuplikan masukkan kedalam kuvet spektrofotometer Atur monokromator eksitasi pada suatu  didaerah u.v. (misal A). Kemudian monokromator emisi diputar sampai diperoleh intensitas yang maksimal misal B nm (B :  emisi) Atur monokromator, emisi pada B nm dan sekarang monokromator eksitasi yang diubah sampai diperoleh intensitas yang maksimum misal A’ nm (A’ nm =  eksitasi) Monokromator eksitasi diatur pada A’ nm dan buat spektra emisi dengan merecord intensitas sebagai fungsi dari panjang gelombang () akan diperoleh harga  yang mempunyai intensitas maksimal misal : B’ nm Maka  eksitasi : A’ nm  emisi : B’ nm

Beberapa obat yang bersifat fosforisensi Senyawa Aspirin Bennocaine Cocaine Diazepam Iproniazid Papaverine Phenacetin Strychnin PO4 Thioridazine  eks 240 310 290,325 300,370 260 410 290 335  fos 380 430 400 400,470,510 440 480 499 500 Waktu 2,1 3,4 2,7 0,07 - 1,5 1,2 Kondisi EPA Epharm Ethanol EW EW : Ethanol – water = 1 : 1 EPA : campuran Diethyleter-isopentane-ethanol (5:5:2)

Intensitas fluoresensi Latihan Soal Jelaskan penggunaan fluoresensi dan fosforesensi dalam analisis kualitatif dan kuantitatif obat atau metabolitnya ? Suatu senyawa griseofulvin standar disiapkan pada pH 7, intensitas fluoresensinya diukur pada λ eksitasi dan emisi masing-masing pada 295 nm dan 450 nm serta memberikan data sebagai berikut : Hitunglah konsentrasi obat (dalam ng/mL) dalam sampel yang memiliki intensitas fluoresensi sebesar 64 ! Konsentrasi (ng/mL) 10 20 40 Intensitas fluoresensi 42,5 85

HATUR NUHUN PISAN ...... Jangan lupa untuk membaca literatur lainnya baik dari buku maupun internet serta banyak latihan soal ... Kita BISA karena BIASA ...