Tri setyawati Biokimia FKIK Tadulako IMUNOHISTOKIMIA Tri setyawati Biokimia FKIK Tadulako

IMUNOHISTOKIMIA Aplikasi dasar dan teknik imunologi dalam mempelajari sel dan jaringan Dasar: reaksi antigen – antibodi Manfaat: - identifikasi – lokalisasi – karakterisasi antigen - menentukan diagnosis, terapi, dan prognosis kanker

IMUNOHISTOKIMIA Banyak cara yang dapat dipakai untuk melokalisir antigen Tergantung pada kebutuhan individual, yaitu: - jenis jaringan - derajat sensitivitas - waktu dan biaya processing

Antigen umumnya berbentuk protein (kadang karbohidrat) Bereaksi dengan bagian (monoklonal) atau bagian-bagian (poliklonal) antigen yang disebut epitop Dapat berubah karena fiksasi atau embedding Cocktail Antibodi

Perlu dilakukan seleksi antibodiBeberapa epitop resisten terhadap pemrosesan jaringan rutin Antigen unmasking (antigen retrieval) Treatment dengan enzyme HIAR ( heat-induced antigen retrieval method): direndam dalam buffer dan dipanaskan dengan microwave, hot-plate, pembakar Bunsen, steamer, atau pressure cooker Hampir semua antigen berhasil baik dengan HIAR Antigen

Konservasi Antigen Antigen, terutama antigen permukaan ekspresi- nya bisa sangat lemah atau hilang pada: FS dan proses rutin (fiksasi & embedding) Pencegahan dengan jenis fiksasi tertentu: - fiksasi berbasis alkohol: ethanol, Carnoy, methacarn  intermediate filament protein - logam berat: B5 & Zenker  antigen intranuclear - Bouin  neuropeptida biogenic amine - periodate-lysine-paraformaldehida  stabilisasi lipid, protein, protein membran     fiksasi dengan formalin bufer fosfat

Metoda Antigen-retrieval Proteolytic digestion Heat-induced Antigen Retrieval (HIAR) Combined proteolytic digestion & HIAR

Metoda Antigen-retrieval Proteolytic Digestion Formalin 10% masih merupakan fiksasi yang paling banyak digunakan  kadang perlu antigen retrieval Formalin menyebabkan cross-linkage antar protein (terutama asam amino dasar: lysine), atau yang lain: amino, amido, peptida, guanidil, hidroksil, karboksil, sulfhidril, aromatik  “mask” antigen yang dicari. Digesti proteolitik akan memecah “masking cross-linkage” Trypsin tipe II 0,25 mg/ml, 37o, 3 menit

Metoda Antigen-retrieval Heat-induced Antigen Retrieval (HIAR) Dasarnya adalah pemanasan HIAR (pemanasan) mulai dari pengukusan, autoclave, pressure cooker, waterbath, sampai oven microwave Shi (1991) pertama kali melakukan dengan microwave Pemanasan 100o C dengan microwave sambil direndam dalam logam berat (Pb tiosianat atau dengan seng sulfat)  unmasking antigen Perendaman juga bisa dengan bufer sitrat 10 mmol dengan pH 6,0 Juga baik untuk sediaan sitologi

Metoda Antigen-retrieval Combined proteolytic digestion & HIAR Kombinasi HIAR dengan dengan digesti proteolitik memberikan hasil optimal, misalnya untuk MiB-1dan Ki-67 Dipakai kombinasi antara tripsin tipe II, 0,25 mg/ml selama 3 menit pada suhu 37o C, sesudah itu dilanjutkan dengan HIAR Sebaliknya pada cytokeratin:HIAR dahulu baru kemudian digesti proteolitik, hasilnya lebih baik

Antigen morfologis tidak bisa diidentifikasi  perlu visualisasi dan dilokalisasi Teknik pengecatan tertentu berdasarkan reaksi antigen-antibodi Imunofluoresen (latar belakang tidak tampak) Imunohistokimia (immunoenzyme technique)  Latar belakang tampak

Imunofluoresen Direct method Deteksi produk infeksi virus/mikroba, juga pada tanaman, penyakit ginjal (komplek antigen-antibodi) Pewarna: - FITC (fluorescein isothiocyanate) - TRITC (Tetramethylrhodamine isothiocyanate)

Direct method Antigen dilokalisasi dengan inkubasi 1 step dalam antibodi yang dikonjugasi dengan marker. Keuntungan: sederhana, hasil cepat Keterbatasan: Tidak tampak morfologi latar Perlu antibodi terkonjugasi setiap antigen yang berbeda Rekomendasi: - Identifikasi imunoglobulin, komplemen, komplek imun pada biopsi ginjal dan kulit - Melokalisasi antigen viral, bakterial, proto- zoal, dalam smear atau cairan tubuh FITC / TRITC Antibodi primer Antigen

Indirect Method FITC / TRITC Prosedur dua langkah, pertama inkubasi dengan antibodi primer, kemudian antibodi sekunder terkonjugasi Keuntungan: Versatility, dan lebih sensitif daripada direct method. Keterbatasan: Latar tidak tampak Harus dengan frozen section Rekomendasi: Antibodi dalam serum (dipakai sebagai antibodi primer: peny. Otoimun, bakterial, dan parasit) Antibodi sekunder Antibodi primer Antigen

Ginjal: Immune complex nephritis & anti GBM disease

Ginjal: IgA nephropathy

Produk infeksi virus: Adenovirus

Produk infeksi virus: CMV

Produk infeksi virus: HSV1

Teknik imunohistokimia Ada dua komponen utama Antibodi primer Sistem deteksi  identifikasi hasil reaksi antigen-antibodi - sistem pewarnaan (chromogen) - komponen jembatan/penghubung (antibodi sekunder)

ANTIBODI Antibodi adalah suatu immunoglobulin Merupakan reagen inti pada teknik imunohistokimia Jumlahnya terus bertambah Manfaatnya terus bertambah

ANTIBODI Ada 5 kelas dalam plasma / serum (sesuai jumlahnya) dalam urutan sbb: IgG – IgA – IgM – IgD – IgE Setiap Ig terdiri dari dua rantai berat (H) identik dan dua rantai ringan (L) identik Rantai H berbeda dalam hal properti antigenik dan struktural, dan menentukan klas dan subklas molekul Kelas: gamma (IgG), alpha (IgA), mu (IgM), delta (IgD), dan epsilon (IgE) Subkelas: dengan subskrip angka mis. IgG1 Rantai L ada 2 tipe, kappa & lambda

ANTIBODI – IgG Formula umum: gamma-kappa atau gamma-lambda Struktur molekul ditentukan oleh digesti proteolitik dan dissosiasi reduktif Digesti papain  pecahnya ikatan yang rentan pada sisi teminal-N dari jembatan disulfida antar-rantai H  2 Fab (antigen binding fragment) heterogen monovalent, dan 1 Fc Digesti pepsin  2 Fab, sedang Fc hancur

Struktur Molekul Imunoglobulin Intra-chain disulfide bond L Inter-chain disulfide bond H

IgG kelinci Variable domain Constant domain Proteolytic digestion with papain Pepsin digestion

Antibodi Antibodi sebagian besar dari subklas IgG, dan sedikit dari IgM Antibodi yang bereaksi dengan antigen disebut antibodi primer Tergantung pembuatannya, ada dua jenis antibodi: antibodi poliklonal (PoAb) dan antibodi monoklonal (MoAb)

Antibodi poliklonal (PoAb) Antibodi polikonal diproduksi oleh berbagai macam sel  imunologik tidak sama  PoAb mengenali berbagai epitop yang berbeda dari antigen yang sama  lebih sensitif daripada MoAb Kelemahan: Masih mengandung antibodi non-spesifik  tak dikehendaki Kecenderungan warna latar yang kuat Batch yang berbeda antar pabrik  komparasi antar-lab sulit

Antibodi poliklonal Gambaran skematik antibodi poliklonal mengikat berbagai epitop pada antigen

Antibodi monoklonal (MoAb) Dibuat dengan hibridoma  klon tunggal sel plasma  antibodi yang hanya mengenali epitop tunggal  diproduksi dengan konstan, tak terbatas, dan persis sama Sensitivitas mungkin kurang dari PoAb  cocktail (untuk meningkatkan sensitivitas) Sangat spesifik

Antibodi monoklonal Antibodi monoklonal bereaksi dengan epitop spesifik pada antigen

Sistem Deteksi 2 komponen: antibodi sekunder / bridging antibody dan color development system (sistem pewarna) Antibodi sekunder menghubungkan antibodi primer dengan sistem pewarna  antibodi sekunder (goat antimouse IgG) merupakan antibodi terhadap imunoglobulin dari antibodi primer (mouse IgG) ABC + DAB/AEC Substrat + H2O2 + chromogen (DAB/AEC)

Pitfal: kekeliruan interpretasi Misinterpretasi: negatif palsu: hilangnya antigenisitas (prosesing), hilangnya aktivitas antibodi primer positif palsu: non-spesific staining Hasil palsu karena terjadi sesuatu pada: Jaringan Antibodi primer Antibodi sekunder Sistem deteksi Perlu kontrol eksternal dan internal

Pitfal: kekeliruan interpretasi Hasil palsu karena terjadi sesuatu pada: Jaringan: antibodi terlalu pekat, antigen masking  HIAR Antibodi primer: - bila kurang spesifik  non-specific binding  false positive (terutama antibodi poliklonal) - antibodi rusak Antibodi sekunder: - = antibodi primer - tidak cocok  false negative Sistem deteksi: endogenous peroxidase activity

Hasil Positif Palsu Reaksi silang dengan antigen yang lain Pengikatan non-spesifik antibodi kepada jaringan Adanya peroksidase endogen dalam elemen selular Jaringan normal terperangkap di dalam jaringan tumor (jar.otot dalam tumor jaringan lunak  rhabdo-myosarkoma; jaringan tiroid dalam limfoma maligna  dikira karsinoma tiroid; dll.) Lepasnya protein sitoplasma sel normal karena invasi tumor  permeasi ke dalam sel interstisial atau fagositosis  positif palsu

Hasil Negatif Palsu Antibodi tidak cocok, rusak, atau konsentrasi tidak tepat Antigen hilang/habis karena otolisis atau difusi, misalnya bila jaringan terlalu lama dalam formalin  lebih baik dalam blok Keberadaan/densitas antigen di bawah level kemampuan deteksi oleh reagen atau teknik yang digunakan, ini karena produksi yang rendah atau hilang

Direct method Antigen dilokalisasi dengan inkubasi 1 step dalam antibodi yang dikonjugasi dengan marker. Keuntungan: sederhana, hasil cepat Keterbatasan: Hasil inkonsisten (parafin) Perlu antibodi terkonjugasi setiap antigen yang berbeda Rekomendasi: - Identifikasi imunoglobulin, komplemen, komplek imun pada biopsi ginjal dan kulit - Melokalisasi antigen viral, bakterial, proto- zoal, dalam smear atau cairan tubuh Enzim peroxidase Antibodi primer Antigen

Indirect Method Enzim peroxidase Prosedur dua langkah, pertama inkubasi dengan antibodi primer, kemudian antibodi sekunder terkonjugasi Keuntungan: Versatility, dan lebih sensitif daripada direct method. Keterbatasan: Makan waktu Hasil terbaik dengan frozen section Rekomendasi: Antibodi dalam serum (dipakai sebagai antibodi primer: peny. Otoimun, bakterial, dan parasit) Antibodi sekunder Antibodi primer Antigen

Peroxidase-anti-Peroxidase Enzim peroxidase Anti peroxidase 3. PAP-complex Keuntungan: Lebih sensitif daripada conjugated antibodies Hasil pewarnaan sangat baik Keterbatasan: Makan waktu Spesies untuk pembuatan PAP complex = antibodi primer Rekomendasi: Identifikasi tumor tanpa tergantung morfologi atau diferensiasi Lokalisasi ultrastruktur  plastik resin 2. Antibodi sekunder 1. Antibodi primer Antigen

Avidin-Biotin-Complex (ABC) Enzim peroxidase Biotin Avidin 3. Komplek konjugasi Teknik ini memanfaatkan kemampuan gliko- protein avidin untuk mengikat 4 molekul biotin 2. Antibodi sekunder terkonjugasi biotin 1. Antibodi primer spesifik untuk antigen tertentu Keuntungan: Komplek konjugasi dapat dipakai untuk setiap jenis antibodi (beda spesies) Hasil sangat baik pada preparat blok parafin Keterbatasan: makan waktu, dan reagensia harus cocok dan dilusiharus akurat Rekomendasi: Antigen permukaan jumlah sedikit Bagus untuk blok parafin yang disimpan lama Antigen

Lokasi antigen Dalam inti Dalam sitoplasma Dalam sitoplasma dan inti Membran sitoplasma: luminal (CA242)

Nuclear staining

Nuclear staining

Nuclear staining

Nuclear staining

Nuclear staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Cytoplasmic staining

Chromogranin: tumor Carcinoid (gaster) Antibodi primer ini negatif pada ca gaster. Keluarga kromogranin, tersusun oleh glikoprotein asam dengan berat molekul 20 – 100 kD, lokasi di dalam fraksi-fraksi terlarut, terdiri dari chromogranin A, chromogranin B (screto- granin I), dan chromogranin C (secretogranin II)  hampir setiap tumor neuroendokrin positif  “pan-endocrine” marker

Metastasis Karsinoma Lobular ke Tiroid Antibodi primer: thyroglobulin. Thyroglobulin berasal dari folikel tiroid yang terperangkap merembes ke sela interselular  Positif (warna merah)

Keratin/Cytokeratin Family of water-insoluble , intracellular fibrous proteins present in almost all epithelia 20 sub-klas Berat mol 40 – 68 kD pH isoelektrik: 5 – 8 Baik untuk marker diferensiasi epitel, tak peduli apakah tumor berasal dari endodermal, neuro-ektodermal, mesenkimal, atau sel benih CK8 & CK18 diekspresikan juga pada jaringan non-epitelial dan neoplasmanya

Keratin/Cytokeratin Contoh Ekspresi Keratin CK8 & CK18 : diekspresikan juga pada jaringan non-epitelial dan neoplasmanya 34β12 : sel basal  DD antara Ca prostat dif. baik dengan BPH CK7+/CK20+ : Ca pankreas, bile duct, urothelium (masing-masing 65%), dan gaster (33%) CK7+/CK20- : Ca paru, mama, endometrium, ovarium, tiroid, kel.ludah, mesotelioma. CK7-/CK20+ : Ca kolon (95%), sel Merkel, gaster (33%) CK7-/CK20- : Ca kortex adrenal, hati, ginjal, kelenjar adrenal CK5/CK6 : DD mesotelioma dengan Ca paru; SCC, Ca kelenjar ludah, timoma

Keratin Ca anaplastik pankreas Thymoma tipe B1, lymphocyte rich

CMV Colitis viral: penderita immunosuppressed

Imunoperoksidase Antigen A: peroxidase antibody conjugate, direct; B: peroxidase antobody conjugate, indirect; C: labeled antigen method; D: Enzyme bridge procedure; E: peroxodase-anti-peroxidase, PAP immune complex method PX: peroxidase Antigen

Biotin-Avidin Immunoenzymatic Techniques Biotinylated primary antibody method Antigen Biotinylated peroxidase method Avidin-biotin-peroxidase complex method

Kontrol Kontrol reagen Kontrol prosedur Penggantian reagen Antibodi primer Reagen lain Kontrol jaringan Kontrol jaringan negatif Kontrol jaringan positif Kontrol jaringan internal