Penentuan Akurasi dan Presisi Mikropipet PCR gen aktin dari zebra fish Praktikum Biselmol I Penentuan Akurasi dan Presisi Mikropipet PCR gen aktin dari zebra fish

Mikropipet

Teknik Pipeting

Akurasi dan Presisi Semakin besar E% ? Semakin besar nilai RSD Pengukuran yang baik jika? 𝐸%= 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑅𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑢𝑘𝑢𝑟𝑎𝑛−𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑥 100 𝑅𝑆𝐷= 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟 𝐷𝑒𝑣𝑖𝑎𝑠𝑖 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑢𝑘𝑢𝑟𝑎𝑛 𝑥 100

PCR Metode amplifikasi DNA in vitro Amplifikasi DNA spesifik dengan proses replikasi DNA berulang kali 1 pg DNA dapat diamplifikasi menjadi 0,5 - 1 g DNA Urutan basa DNA yang akan diamplifikasi perlu diketahui

Replikasi DNA: semi-konservatif Satu molekul DNA menjadi 2 molekul DNA Masing-masing molekul DNA baru: 1 untai lama 1 untai baru Untai lama menjadi templat bagi untai baru

Sintesis DNA DNA polimerase selalu memerlukan: DNA templat (cetakan) DNA primer Kofaktor Mg++ Substrat dNTP: dATP dGTP dCTP dTTP 3’-OH dari gula bereaksi dengan fosfat dNTP Pirofosfat dilepas Arah sintesis DNA selalu dari 5’ ke 3’ 5-8 Mathews et al. (2000) Electronic study guide for Biochemistry

Replikasi DNA in vitro Pemisahan kedua rantai DNA dengan Alkali Pemanasan Penyediaan primer Oligonukleotida yang komplementer dengan templat

PCR Memerlukan Templat Sepasang primer DNA polimerase termostabil Mg++ dNTP

Templat PCR Fragmen DNA yang akan diamplifikasi ada pada templat Urutan DNA yang akan diamplifkasi sudah diketahui Minimal 1 molekul DNA Sumber: Darah, sperma & jaringan lain (yang segar maupun yang sudah lama) Koloni bakteri, plaque DNA murni

Primer Panjang 18 - 30 nt Menentukan fragmen mana yang akan teramplifikasi Tm = suhu dimana separuh dari rantai DNA sudah terpisah Tm harus sama. Untuk primer < 25 nt: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Dapat ditambahkan sisi pengenalan enzim restriksi pada ujung 5’ dari primer Bila hanya diketahui urutan asam amino dari protein, dapat dibuat primer degenerate

DNA polimerase termostabil Enzim Taq DNA polimerase Berasal dari Thermus aquaticus Pada 95oC, t1/2 = 2 jam Tidak mempunyai aktivitas exonuklease 3’  5’ (“proofreading”) akibatnya tingkat kesalahan replikasi DNA relatif tinggi Pada ujung 3’ ditambahkan dA Enzim Pfu DNA polimerase Berasal dari Pyrococcus furiosus Pada 95oC selama 90 menit, aktivitas masih 90% Mempunyai aktivitas exonuklease 3’  5’ (“proofreading”) Menghasilkan DNA ujung tumpul

Proses PCR 95oC, 3 menit Denaturasi awal 1 x 95oC, 1 menit Denaturasi Penempelan primer 25-35 x 72oC, 1 menit Elongasi 72oC, 3 menit Elongasi akhir Ukuran DNA hasil PCR ditentukan dengan elektroforesis gel agarosa