Mekanisme Pemisahan pada Kromatografi Cair Oleh: Purwadi, M.Si Disampaikan pada kuliah Kromatografi, UTB 2009

Elusi

Kromatografi Cair (KC) Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak cairan Bagaimana fase diamnya? Jawab Bisa padat bisa juga cair

Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi Gas hanya 10%, mengapa ? Karena Kromatografi Cair Mempunyai banyak mekanisme pemisahan Tidak ada persyaratan analit harus menguap, sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik didih relatif tinggi Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan) Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt Tidak harus mahal: KLT, KKt

Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak Fase gerak gas Fase gerak cair Kromatografi Gas Krom. Kolom K L T Krom. Kertas KCKT KK. Terbuka KK. Vakum Kroma-totron

Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi jenis peralatan ? Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti berbeda dengan KCKT? Jawab Jenis peralatan tidak mempengaruhi mekanisme pemisahan secara kromatografi Cair Terkadang mekanisme pemisahan dalam KLT sama dengan KCKT

ADSORBSI KCKT PARTISI PERTUKARAN ION KLT KROM. ION Krom. Kertas Mekanisme PASANGAN ION Krom Kolom SIZE EXCLUSION Kolom FILTRASI GEL PERMEASI GEL

Mengapa begitu banyak mekanisme? Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi mempunyai bermacam mekanisme? Jawab Tidak, dalam satu kromatografi “hanya” terdapat satu mekanisme saja Misal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme Adsorbsi Misal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme partisi

Farktor apa yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi? Jawab Yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin dipisahkan

KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI ADSORBSI Untuk analit yang bagaimana? Jawab: untuk analit yang polar Bagaimana prinsipnya: Adsorbsi dan desorbsi

Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsi Jawab Anda ingat like disolve like, seperti itulah mekanismenya Perjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)

Berdasarkan perjanjian tersebut Jika fase diam Polar, kemudian Ada campuran analit, dengan sifat Polar dan lainnya non polar, maka yang bersifat polar akan disukai oleh fase diam (dengan kata lain teradsorbsi lebih kuat) dibanding analit lain yang kurang polar. Analit Lebih polar m = fase gerak s = fase diam (polar)

Cerita mekanisme adsorbsi Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam, selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding analit yang kurang polar. Sehingga => terjadi pemisahan

Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi Digunakan untuk pemisahan analit yang bersifat polar Fase diam yang digunakan bersifat polar: misal Silika dan Alumina Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika pada KLT atau pun KCKT dll maka mekanismenya adalah adsorbsi

Kolom HPLC fase normal Silica gel : pemakaian umum Cyano : pemakaian umum Amino : analisa gula Diol : analisa protein -Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH) Si Si Silica gel Modifikasi Si

Kasus: Suatu Campuran berisi Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai Rf lebih tinggi??

Jawab

Ikatan hidrogen Non-polar Silica gel (polar)

Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika? kuat HO SiOH SiOH lemah OH

KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI PARTISI Untuk analit yang bagaimana? Jawab: untuk analit yang Non-polar Bagaimana prinsipnya: partisi

Apa yang dimaksud dengan partisi? Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi jika analit dimasukkan dalam corong pisah yang berisi dua cairan yang tidak saling larut? Analit tersebut setelah terjadi kesetimbangan sebagian akan masuk ke cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke cairan dua.

Apakah bisa fase diam berupa cairan? Jawab: bisa Apakah tidak terjadi abrasi jika terkena aliran fase gerak? Jawab: bisa. Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi? Jawab: cairan tersebut ditambatkan dalam padatan

Bagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36 sebagai fase diam? Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan padatan silika. -Si-C18H35 Si

Perjanjian: Kromatografi partisi: menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar Sistem kromatografi dengan menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar dikenal sebagai fase balik

Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi menjelaskan pemisahan kedua analit beikut? Jawab: Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar. Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase gerak. Senyawa B akan terparisi lebih banyak dalam fase diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan tertahan lebih lama pada fase diam

Bagaimana interaksi? Interaksi hidrofobik Solven polar Non-polar

Hidrofobisitas Hidrofobisitas Jadi lebih kuat. Jika sampel memiliki CH3CH2CH2--- : rantai karbon : gugus aromatis -COOH : gugus karboksil -NH2 : gugus amino -OH : gugus hidroksil X Hidrofobisitas Jadi lebih kuat. Hidrofobisitas jadi lebih lemah.

Waktu retensi dan Hidrofobisitas OH C18 (ODS) lemah kuat OH

Pengaruh fase diam C8 Medium C18 (ODS) sampel kuat C4 sampel lemah

Mekanisme pemisahan untuk melekul ionik

Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan untuk analit ion? Kromatografi pasangan ion Kromatografi penekanan ion Kromatografi pertukaran ion

Kromatografi Pasangan Ion Apa dasar pasangan ion? Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi beberapa mekanisme, jika hal tersebut terjadi maka dapat mengakibatkan pemisahan tidak baik, misalnya terjadi pengekoran dan atau puncak pecah.

Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak partisi dengan sedikit adsorbsi

Kromatografi Fase Terbalik dengan pasangan ion Ion-Pair Reagent

Untuk apa dipasangkan? Jawab. Agar molekul analit netral sehingga bersifat non polar. Ingat: PARTISI: Pemisahan senyawa non polar dengan fase diam non polar (misal C-18)

Reagen Ion-Pair Untuk Analit bersifat Anion, maka pasangannya: Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA) Untuk Analit bersifat Kation, maka pasangannya: Butanesulfonic acid sodium salt (C4) Pentanesulfonic acid sodium salt (C5) Hexanesulfonic acid sodium salt (C6) Heptanesulfonic acid sodium salt (C7) Octanesulfonic acid sodium salt (C8) Decanesulfonic acid sodium salt (C10)

Ion Pairing Separation of Carboxylic Acids

Pasangan Ion Hal yang penting diperhatikan Tipe reagen Ion-Pair Konsentrasi reagen Ion-Pair pH solven R-COOH RCOO- + H+ (pKa=4.5) R-NH2 + H+ R-NH3+ (pKa=6.0)

Tipe reagen ion-pair Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate

Mekanisme: Penukar ion Jika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion Kekuatan antar ion R N+ R Sampel R

SO3- + + + + + + Sampel + + + + + + + Jika analit kation maka fase diam anion, fase gerak kation + + + + + + SO3- Sampel + + + + + + +

Penukar ion Lingkungan biologi (protein, peptide, amino acid analysis) Kromatografi ion Penukar kation Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3-) Week Cation Exchange (WCX) (R-COO-) Penukar anion Strong Anion Exchange (SAX) (R4N+) Week Anion Exchange (WAX) (DEAE)

Hal yang perlu diperhatikan pada Kromatografi Penukar ion pH larutan dapar Konsentrasi larutan dapar Metoda elusi Elusi Isokratik Elusi gradien pH Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik

Mekanisme pemisahan berdasarkan ukuran molekul

Apakah SEC ? Size Exclusion Chromatography (SEC) GPC (Gel Permeation Chromatography) terutama untuk sampel polimer GFC (Gel Filtration Chromatography) terutama untuk sampel biologi

Prinsip SEC Tidak ada kekuatan interaksi Perbedaan waktu tempuh

SEC Fase diam: partikel berpori Molekul ber BM besar Molekul relatif besar tidak dapat dijebak oleh fase diam, akibatnya waktu tambat singkat Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase diam, akibatnya waktu tambat lama

Hubungan antara Bobot molekul & waktu tambat Batas eksklusi Berat molekul (LogMW) Batas permeasi Kolom GPC Waktu

Kromatografi Afinitas

Pustaka SusanR.Mikkelsen and Eduardo Corton, 2004, BIOANALYTICAL CHEMISTRY, A JOHNWILEY&SONS, INC., PUBLICATION, New Jersey. PT. Ditek Jaya. Presentation for Shimadzu LC