LECTURE 3: ENZYME STRUCTURE AND MODEL

Struktur Enzim Apoenzyme + Coenzyme = Holoenzyme Bagian protein Grup prostetik Enzim lengkap (tidak aktif) (tidak aktif) (aktif)

the protein part of the enzyme molecule Apoenzyme the protein part of the enzyme molecule Struktur protein enzim sangat kompleks dan berfungsi menyediakan lingkungan untuk kelangsungan reaksi dengan mekanisme tertentu Fungsi lain adalah sebagai tempat patron (template) substrat, dan karenanya protein enzim berfungsi mengenal substrat yang dipertimbangkan menjadi dasar spesifitas enzim Cofactor the additional/tambahan chemical groups appearing/muncul in those/itu enzymes that are conjugated proteins.

Cofactors can be divided/bercabang into three groups These cofactors are required/memerlukan for enzyme activity and may consist/terdiri of metal ions or complex organic molecules. Some enzymes require both types of cofactors. Cofactors can be divided/bercabang into three groups (i) Prosthetic group (ii) coenzyme (iii) Metal Activators

Prosthetic group Coenzyme In the enzyme molecule, the cofactor may be weakly/lemah attached/dempet to the apoenzyme, or it may be tightly/rapat sekali bound/loncatan to the protein. If it is tightly bound, the cofactor is called a prosthetic group Example: bagian porphyrin (moiety) dari hemoprotein peroxidase dan flavin-adenine dinucleotide dalam succinic dehydrogenase Coenzyme When the cofactor of an enzyme is a complex organic molecule other than a protein, the cofactor is called a coenzyme Example: NAD+, NADP+, tetrahydrofolic acid dan thyamin pyrophosphate

Perubahan Glucose 6-phosphate ke 6 Phosphogluconic acid lactone oleh suatu enzim dehydrogenase. Coenzymenya adalah coenzyme II; NADP+& TPN (Triphosphopyridine nucleotide) yang disebut Zwischenferment pada awalnya. Reaksi ini terjadi melalui dua tahap reaksi yaitu oksidasi fosfat gula (glucose 6-phosphate) dan reduksi coenzyme

Activator When the cofactor of an enzyme is a metal ion, such as the ions of magnesium, zinc, ion or manganese), the cofactor is called an activator Examples: K+, Mn+2, Mg+2, Ca+2 dan Zn+2 Isoenzyme Enzymes that perform the same catalytic function in different body tissues/jaringan or different organisms, but which have different sequences/rangkaian of amino acids in various/bermacam portions/bagian of their polypeptide chain/rantai are called isoenzymes. Isoenzymes can be separated/terpisah from one another/yang lain by electrophoresis.

Proenzyme or zymogen Substrates Proenzyme (or zymogen) is the name given to the inactive form/bentuk of an enzyme. Enzymes (especially/terutama digestive/mempercepat pencernaan enzymes) are often secreted/dirahasiakan in their inactive form, transported to the place where activity is desired/diinginkan, and then converted/dimasukkan to their active forms. Substrates The substrate is the chemical substance/zat or substances upon which the enzyme acts/tindakan

Enzim monomerik; yang memiliki hanya satu rantai polipeptida dimana terdapat tempat aktif. Enzim oligomerik; yang memiliki paling sedikit 2 dan sebanyak 60 atau lebih subunit yang terikat kuat dalam pembentukan protein enzim aktif. Kompleks multienzim; yang terdiri dari sejumlah enzim yang terikat kuat

Enzym-Substrate Interaction Lock and Key" Hypothesis The "Induced Fit/disebabkan pas" Hypothesis "Lock and Key" Hypothesis Emil Fischer in 1890 proposed "Lock and Key" Hypothesis The shape/bentuk, or configuration/susunan, of the active site is especially designed for the specific substrate involved/diliputi.

Because the configuration/susunan is determined/ditentukan by the amino acid sequence/rangkaian of the enzyme, the native/asli configuration of the entire/seluruh enzyme molecule must be intact/lengkap for the active site to have the correct configuration. In such a case/tempat, the substrate then fits into the active site of the enzyme in much the same way as a key fits/pas into a lock/kunci.

Lock & Key Model

The "Induced Fit" Hypothesis Enzymes are highly flexible/lunak, conformationally/menyesuaikan diri dynamic/dinamis molecules, and many of their remarkable/luar biasa properties, including/dimasukkan substrate binding and catalysis, are due/hak to their structural pliancy. Realization of the conformational flexibility of proteins led/berperan penting Daniel Koshland to hypothesize that the binding of a substrate (S) by an enzyme is an interactive process. That is, the shape/bentuk of the enzyme's active site is actually/benar2 modified upon binding S, in a process of dynamic recognition/pengenalan between enzyme and substrate aptly/dengan tepat called induced/disebabkan fit/pas.

In essence/pokok, substrate binding alters/merubah the conformation/menyesuaikan diri of the protein, so that the protein and the substrate "fit" each other more precisely/dengan tepat. The process is truly interactive in that the conformation of the substrate also changes as it adapts to the conformation of the enzyme.

Induced Fit Model

Enzyme Kinetics Sucrose + H20 Glucose + Fructose Enzymes follow zero order/urutan kinetics when substrate concentrations are high. Zero order means there is no increase/pertambahan in the rate/dasar of the reaction when more substrate is added. Given the following breakdown/kerusakan of sucrose to glucose and fructose Sucrose + H20 Glucose + Fructose

Reaksi bersifat dapat balik yaitu sebagian senyawa dapat disintesis kembali dari zat yang terdapat dalam reaksi Jika faktor lingkungan tetap, kecepatan pembentukan produk (kecepatan reaksi) ditentukan oleh konsentrasi enzim dan substrat V = kecepatan reaksi, [E] = konsentrasi enzim & [S] = konsentrasi substrat

Apabila [S] tetap, kecepatan reaksi me-ningkat sebanding dengan peningkatan [E] Gambar 6. Hubungan antara kecepatan reaksi (V) dengan konsentrasi enzim (kiri), dan dengan waktu pada [E] yang berbeda (kanan)

Apabila konsentrasi enzim tetap dan substrat meningkat, V akan meningkat mula-mula dan proporsional dengan peningkatan [S], tapi pada [S] yang lebih tinggi, laju peningkatan V menurun secara perlahan-lahan hingga kemudian V hampir tidak tergantung pada [S]. Vmax V 1/2 Vmax KM [S] Gambar 2.2. Hubungan antara kecepatan reaksi (V) dengan konsentrasi substrat ([S]) pada reaksi yang dikatalisis oleh suatu enzim

MICHAELIS-MENTEN MODEL Leonor Michaelis dan Maud Menten pada tahun 1913 mengusulkan suatu model untuk menjelaskan kinetik reaksi enzimatis untuk satu substrat dan satu enzim (Uni-Uni reaction) Hipotesisnya adalah bahwa Enzim (E), yang bertindak sebagai reaktan tapi tidak digunakan dalam reaksi, menyatu dengan substrat (S) dalam suatu kompleks ES dalam pembentukan produk

ES E+S E+P E = Enzyme, S = Substrate, P = Product 3 k 1 ES E+S E+P 2 4 E = Enzyme, S = Substrate, P = Product ES = Enzyme-Substrate complex k1, k2, k3 & k4 = rate/bentuk constants

When the substrate concentration becomes large enough to force/gaya the equilibrium/kesetimbangan to form completely all ES the second step in the reaction becomes rate/bentuk limiting/batas because no more ES can be made and the enzyme-substrate complex is at its maximum value/nilai. [ES] is the difference/perbedaan between the rates of ES formation minus the rates of its disappearance/hilangnya. 1

Assumption/perkiraan of equilibrium/kesetimbangan k-1>>k2 (k2>>k3) the formation of product is so much slower than the formation of the ES complex. That we can assume/mengambil: 3 k 1 ES E+S E+P 2 4 Ks is the dissociation/pemisahan diri constant for the ES complex.

Assumption/perkiraan of steady/tetap state/keadaan Transient/tempat sementara phase where in the course/jalan of a reaction the concentration of ES does not change 2

Michaelis-Menten Model The Km is the substrate concentration where vo equals one-half Vmax

But how do we analyze kinetic data? There are a wide range of KM, Vmax , and efficiency seen in enzymes But how do we analyze kinetic data?

Penetuan KM dan Vmax Harga KM bervariasi sangat besar, tapi dari kebanyakan enzim berkisar diantara 10-1 - 10-6 M (Tabel 2.1) tergantung substrat dan lingkungan seperti suhu dan kuantitas ion Untuk mendapatkan harga KM dan Vmax, analisis langsung persamaan diatas dapat dilakukan, tapi cara ini membutuhkan waktu yang lama, dan bantuan komputer sangat penting untuk mengoptimasi harga parameter persamaan dengan cepat.

Tabel 2.1 Parameter beberapa enzim *“C = Competitive, NC = Non-competitive & UC = Uncompetitive”

PENDEKATAN LAIN Linierisasi persamaan Modifikasi persamaan ke bentuk linier sehingga dapat dianalisis dengan mudah 1. Persamaan “double-reciprocal” atau “Lineweaver-Burk” 2. Persamaan “Eadie-Hofstee” 3. Persamaan “Hanes-Woolf”

Persamaan “double-reciprocal” atau “Lineweaver-Burk” Jika ruas kiri dibalik dan demikian juga ruas kanan, maka Sekarang persamaan ini akan mudah dianalisis dengan metode linier sedehana

Sekarang y = 1/V ; x = 1/[S] a = 1/Vmax ; b = KM/Vmax dapat dianalisis dengan y = a + bx Jika 1/V dihubungkan dengan 1/[S], suatu garis lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu y pada 1/Vmax dan sumbu x pada -1/KM serta membentuk sudut terhadap sumbu x sebesar KM/Vmax.

Persamaan “Eadie-Hofstee”

Sekarang y = V ; x = V/[S] a = Vmax ; b = -KM dapat dianalisis dengan y = a + bx Jika V dihubungkan dengan V/[S], suatu garis lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu y pada Vmax dan sumbu x pada Vmax/KM serta membentuk sudut terhadap sumbu x sebesar KM

Persamaan “Hanes-Woolf”

Sekarang y = [S]/V ; x = [S] a = KM/Vmax ; b = 1/Vmax dapat dianalisis dengan y = a + bx Jika [S]/V dihubungkan dengan [S], suatu garis lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu y pada KM/Vmax dan sumbu x pada -KM serta membentuk sudut terhadap sumbu x sebesar 1/Vmax.

STEPS OF MODEL DERIVATION

STEPS OF MODEL DERIVATION Pembentukan ES adalah inti dari hipotesis tersebut Reaksi E dengan S terjadi dengan kecepatan k1 dan menghasilkan kompleks ES (enzim-substrat) Kompleks ES dapat berubah menjadi E dan S bebas kembali dengan kecepatan k2, atau menjadi E dan P dengan kecepatan k3. 3 k 1 ES E+S E+P 2 4

Jika k3  k4 , maka reaksi bersifat “irreversible”, sehingga produk P tidak ada yang diubah kembali menjadi substrat asal dan k4 dapat diabaikan. Suatu hal penting yang perlu diingat adalah bahwa konstanta k1, k2, k3 dan k4 proporsional dengan G aktivasi substrat dari reaksi yang bersangkutan Pada [S] yang rendah, kebanyakan enzim berada dalam bentuk bebas, sehingga penambahan S akan langsung terikat dengan E dan diubah menjadi P dengan demikian kecepatan awal proporsional dengan peningkatan [S] (1)

Pada [S] yang lebih tinggi, kecepatan reaksi bervariasi dengan peningkatan [S] karena enzim mulai mengalami kejenuhan Pada [S] yang tinggi, semua enzim dijenuhi oleh substrat dan karenanya berada dalam bentuk kompleks ES Jadi enzim dalam suatu reaksi dapat berada dalam keadaan bebas dan terikat dengan substrat, sehingga total enzim secara matematis adalah [E]0 = [E]+[ES] (2)

Penurunan persamaan Michaelis-Menten tergantung pada asumsi yang disebut ”Briggs-Haldane Steady-State” Keadaan "steady state" adalah suatu keadaan dimana konsentrasi intermediat (perantara) ES tetap konstan, sementara konsentrasi substrat dan produk berubah Keadaan demikian terjadi apabila kecepatan pembentukan ES sama dengan kecepatan peruraian ES

Keadaan “steady” dapat dinyatakan secara matematis seperti dengan persamaan berikut [ES]/t = 0 (3) dimana t = waktu (menit) Pernyataan [ES]/t dapat ditulis dari sudut konstanta dan konsentrasi pers (1) yaitu Kecepatan pembentukan ES ES = k1[E][S] (4a)

ES = (k2 + k3) (ES) (4b) = 0 (5) Kecepatan peruraian ES Dalam keadaan "steady state" kedua persaman (4a) dan (4b) adalah sama, sehingga [ES]/t = k1[E][S]-(k2+k3)(ES) = 0 (5)

Subsitusi E dari pers (2) kedalam pers (5) menghasilkan k1[S][E]0 –[ES](k1[S]+k2+k3)=0 (6) Pengaturan persamaan lebih lanjut (7)

Persamaan ini dapat dimodifikasi dengan cara ruas kanan dibagi dengan k1[S], (9) Karena k1, k2, dan k3 adalah konstanta, maka ketiga konstanta ini dapat dijadikan satu konstanta yaitu (k2 + k3 )/k1 = KM yang dikenal sebagai konstanta Michaelis-Menten

Untuk kebanyakan enzim k3  k2, sehingga KM akan mendekati (k2 + k1), sedang (k2 + k3 )/ k1 adalah Ks (konstanta dissosiasi kompleks enzim-substrat). Jika KM, yang merupakan ukuran affinitas enzim akan substrat, disubsitusikan kedalam pers (9), maka (10)

Kecepatan reaksi katalisis dapat dinyatakan dengan jumlah produk yang terbentuk per satuan waktu yaitu produk dari konsentrasi kompleks ES dengan kapasitas katalisis enzim k3 (turnover number). (11) Subsitusi [ES] dari pers. (11) kedalam pers (10) memberikan (12)

Pada keadaan E dijenuhi S yang berarti semua enzim terikat dengan substrat dalam kompleks ES, maka V = Vmax = k3[E]0. Kemudian persamaan diatas dapat ditulis dalam bentuk berikut. atau (13) Persamaan terakhir ini ad. persamaan Michaelis-Menten yang secara luas digunakan utk analisis reaksi enzim.

Stoikiometri pers (13) adalah S P yaitu satu substrat dan satu produk (uni-uni), sementara banyak reaksi yang dikatalisis enzim melibatkan stoikiometri yang lebih kompleks seperti berikut; Untungnya, persamaan Michaelis-Menten kira-kira berlaku untuk reaksi yang lebih kompleks sekalipun dengan mekanisme yang berbeda.