Genomic resources WBC Sejumlah informasi genomik WBC telah tersedia, bisa digunakan dalam studi genetika Noda, H., Kawai, S. and Koizumi, Y., et al. 2008. Annotated ESTs from various tissues of the brown planthopper Nilaparvata lugens: a genomic resource for studying agricultural pests. BMC Genomics 9: 117. Xue, J., Bao, Y.Y. and Li, B., et al. 2010. Transcriptome analysis of the brown planthopper Nilaparvata lugens. PLoS One 5: e14233. Peng, X., Zha, W., He, R., et al. 2011. Pyrosequencing the midgut transcriptome of the brown planthopper, Nilaparvata lugens. Insect Mol. Biol. 20: 745–62. Bass, C., Hebsgaard, M.B. and Hughes, J. 2012. Genomic resources for the brown planthopper, Nilaparvata lugens: transcriptome pyrosequencing and microarray design. Insect Sci. 9: 1–12. Bao, Y., Wang, Y. and Wu, W., et al. 2012. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics 99: 256–64.

Marka SSR WBC 350 e-SSR (EST-derived SSR): Jing et al. (2011); Sun et al. (2011) 136 g-SSR (genomic SSR): Jing et al. (2012) Lokasinya dalam genom belum ditentukan dalam peta genetik Kegunaan peta genetik: alat identifikasi basis genetik variasi fenotipik

Tujuan penelitian Mengkonstruksi peta pautan genetik WBC Menggunakan marka SSR yang sudah ada (published) Menggunakan marka SSR dan SNP hasil pengembangan sendiri menggunakan teknologi sekuensing next-generation

Strain WBC 4 strain WBC migran dari Asia Selatan, berbeda virulensi Dipelihara di laboratorium (25 ± 2oC; 16L: 8D) pada padi japonica var. Reiho (tanpa gen tahan) Strain Tahun Generasi Kode Penggunaan Hanado-66 1966 ~500 H66 Inbred BPH strains (IBS), populasi pemetaan Chikugo-89 1989 >250 C89 IBS, populasi pemetaan Koshi-10 2010 ~20 K10 Izumo-87 1987 ~270 I87 Whole-genome sequencing, deteksi SNP

Sepasang imago dari tiap strain disilangkan (full- sib mating) dalam tabung gelas berisi var. Reiho F1 dipelihara terpisah, nimfa instar-5 dipilih dan disilang balik Tetua-tetua persilangan disimpan dalam alkohol Nimfa instar-2 atau -3 disimpan dalam alkohol

Ekstraksi DNA & amplifikasi Ekstraksi DNA dari tiap individu dari kepala dan dada (thorax) untuk menghindari kontaminasi dari telur yang telah dibuahi dan bakteri simbion; prosedur potassium acetate untuk tanaman (Dellaporta et al. 1987)

Isolasi & deteksi SSR E-SSR G-SSR: DNA genomik IBSs H66 (50 nimfa, ♀, &♂) 2 pustaka: KU (Kyushu Univ.) & SREL (Savannah River Ecology Lab, Univ. of Georgia) dengan 2 metode isolasi berbeda Sekuensing menggunakan Roche 454 GS FLX Titanium system 3160 g-SSR – 418 polimorfik & informatif Penamaan marka: NLGS (Nilaparvata lugens g-SSR) Sekuen EST kontribusi Noda et al. (2008) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 341 pasang primer – 15 polimorfik Penamaan marka: NLES (Nilaparvata lugens e-SSR) 351 published e-SSR – 100 polimorfik (<32%) krn sekuen terkonservasi pada daerah transcribed

Isolasi & deteksi SSR Deteksi pada gel agarose: Total 1037 SSR polimorfik & informatif: 922 g-SSR 15 e-SSR hasil pengembangan sendiri 100 published e-SSR Jika deteksi menggunakan elektroforesis sistem kapiler akan didapatkan lebih banyak marka informatif 408 digunakan pada pop KH dan 213 digunakan pada pop CK

Pencarian SNP Whole-genome sequencing: Strain I87 (sekuen rujukan): Roche 454 GS FLX pyrosequencing Strain IBS-C89: Illumina HiSeq 2000 Penamaan marka: NLSP (Nilaparvata lugens SNP) >100.000 kandidat SNP teridentifikasi, 234 primer SNP dapat mengamplifikasi sekuen target: 79 polimorfik pada I87 & IBS-C89, 46 polimorfik pada tetua pop KH Jumlah SNP valid rendah kualitas sekuen genom rujukan kurang baik strain untuk survei SNP (strain I87 dan IBS-C89) berbeda dengan populasi untuk uji polimorfisme (BC1F1 KH) 79 polimorfik pada I87 & IBS-C89; 46 polimorfik pada tetua pop KH

Konstruksi peta genetik Peta BC1F1 KH: 348 SSR & 44 SNP 18 linkage group (LG), panjang peta 870,2 cM Peta BC1F1 CK: 207 SSR dan 1 STS 16 LG, panjang total 770,7 cM 43 marka yang segregasinya menyimpang dari 1:1, 1:2:1, atau 1:1:1 terletak pada LG 16 Marka spesifik kromosom Y (marka STS PM3n) terpetakan pada ujung LG 16 Peta konsensus (integrasi kedua peta menggunakan 73 marka common sebagai penyambung kedua peta): 17 LG ~ haploid n=15 518 marka terpetakan (400 g-SSR, 74 e-SSR, 43 SNP, 1 STS) Total 1093,9 cM (=92,3% dari ukuran genom WBC yang 1,2 Gbp LG7 terpendek (19 cM) Rata-rata jarak genetik 2,3 cM, ada kesenjangan jarak s/d 43,9 cM (LG 8)

Peta konsensus WBC

Peta konsensus WBC

Peta konsensus WBC

Peta konsensus WBC Penggunaan populasi pemetaan >1 meningkatkan jumlah marka dan genome coverage lebih besar dan mengurangi kesenjangan jarak pada peta konsensus, tetapi kepadatan marka masih dianggap rendah dibandingkan dengan serangga model (Bombyx mori & Apis mellifera) Idealnya dibuat peta terpisah antara jantan dan betina, tetapi jumlah progeni terlalu sedikit (<100)

Identifikasi LG terpaut jenis kelamin (1) Populasi pemetaan menggunakan nimfa instar-5, maka jenis kelamin progeni BC1F1 tidak bisa dipastikan ♀F1 (genotipe X1X2) ♂ populasi CK atau KH (genotipe X1Y1) ♀ (X1X1) ♀ (X1X2) ♂ (X1Y1) ♂ (X2Y1) 1 : Segregasi PM3n sesuai dengan rasio 1 : 1, maka jumlah individu pada BC1F1 CK (89) berkelamin ♀= 44 dan ♂=43 Marka PM3n tidak informatif pada populasi BC1F1 KH

Identifikasi LG terpaut jenis kelamin (2) Sebagian besar marka pada LG16 pop CK menyimpang dari rasio 1: 2 : 1 (tetua homozigus : heterozigus : tetua homozigus), maka diuji segregasi 2:1:1 untuk mengetahui LG yang merupakan kromosom seks ♀F1 (genotipe X1X2) ♂ populasi CK atau KH (genotipe X1Y1) homozygous paternal (X1X1) hemizygous paternal (X1Y1) heterozygous (X1X2) homozygous maternal (X2Y1) 2 1 : Segregasi marka-marka pada LG16 pop CK sesuai rasio 2 : 1 : 1, berarti marka-marka ini berlokasi pada kromosom seks, yang berkorepondesi dengan LG 11 pada peta konsensus

Identifikasi LG terpaut jenis kelamin (3) 6 e-SSR yg berasal dari gen vitellogenin (spesifik utk betina) terpetakan pada LG 11 (peta konsensus); segregasinya sesuai dengan rasio 3 : 1 untuk marka terkait jenis kelamin betina, maka LG 11 adalah kromosom seks

Penutup Genome coverage masih diperlukan agar kesenjangan jarak genetik antar marka dan jumlah LG dapat diperkecil; untuk itu akan diidentifikasi SNP tambahan Resolusi marka 2,3 cM sudah cukup untuk identifikasi QTL, terutama virulensi, yang sangat penting untuk pengelolaan WBC Marka-marka yang telah dikembangkan dapat diaplikasikan untuk kajian genetika dan ekologi WBC (genetika populasi, migrasi, dan evolusi)